血漿中游離藥物分析方法的理論研究與臨床應(yīng)用.pdf

1、藥物在血漿中以不同的程度與血漿蛋白結(jié)合，只有未與血漿蛋白結(jié)合的游離藥物(FD)才能在作用部位產(chǎn)生療效，這是臨床藥理學(xué)的基本共識(shí)。然而在臨床實(shí)踐中FD評(píng)價(jià)并沒(méi)有在臨床得到廣泛應(yīng)用，用血漿中總藥物(TD)濃度去評(píng)價(jià)藥效學(xué)、指導(dǎo)用藥仍然是目前常用的手段，因而，毒副反應(yīng)和治療失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。其原因除了FD與臨床病理生理的關(guān)系目前并不十分清晰外，F(xiàn)D的表征方法的不完善是另一重要原因。因此，研究開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確、適宜臨床的FD分析方法是臨床藥學(xué)工作者面

2、臨的重要課題，也是解決FD評(píng)價(jià)在臨床實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。
　　離心超濾(CF-UF)法是目前FD分析表征的主要方法，但是其所得超濾液的體積(Vu)一般較大，且無(wú)法準(zhǔn)確控制，容易破壞藥物蛋白結(jié)合平衡，導(dǎo)致FD分析的準(zhǔn)確度和精密度受到影響，目前有關(guān)CF-UF準(zhǔn)確度與Vu關(guān)系的理論研究還未見(jiàn)報(bào)道，也未見(jiàn)準(zhǔn)確控制Vu的方法和技術(shù)的報(bào)道。
　　課題以抗癲癇藥-卡馬西平(CBZ)為模型藥物，研究了CF-UF表征FD濃度時(shí)不同的Vu對(duì)

3、FD分析準(zhǔn)確度的影響及規(guī)律，完善了CF-UF表征FD的理論。方法采用高、低兩個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣本，在相同的離心力8.0×103 g下，通過(guò)改變離心時(shí)間(0.5、2、5、10、15和20 min)而得到不同的超濾液與樣本溶液體積比（Vu/Vs），并分別進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示Vu/Vs從0.08增大到0.8，游離的CBZ的濃度逐漸增大，而蛋白結(jié)合率(PB)從70％變到40％，表明隨著Vu/Vs的增加，游離藥物隨超濾液濾出，樣品溶液中結(jié)合

4、藥物的濃度逐步增加，由于藥物與蛋白結(jié)合平衡的存在，與蛋白結(jié)合的藥物會(huì)逐步釋放藥物以滿足平衡的需要?？梢?jiàn)Vu/Vs對(duì)FD表征準(zhǔn)確度的影響是不容忽視的。結(jié)果表明，對(duì)于CBZ，當(dāng)Vu/Vs＜0.2時(shí)，F(xiàn)D的表征結(jié)果才容易被接受。
　　為了準(zhǔn)確控制Vu/Vs，本文提出了中空纖維離心超濾(HFCF-UF)技術(shù)，其Vu/Vs較小且恒定為0.08，CBZ的PB在72％左右，并且在理論上提出了Vu/Vs可以通過(guò)超濾玻璃管和中空纖維（HF）的內(nèi)徑準(zhǔn)

5、確控制，所得結(jié)果更加準(zhǔn)確，為FD分析提供了一個(gè)可靠的技術(shù)手段。
　　蛋白結(jié)合型藥物會(huì)受到Vu/Vs的影響，而對(duì)于非蛋白結(jié)合型(NPB)藥物，采用CF-UF法得到的FD濃度就可以等同于TD濃度，用于臨床藥代動(dòng)力學(xué)等研究。CF-UF法與傳統(tǒng)的TD濃度表征方法相比，操作簡(jiǎn)便，方法學(xué)分析結(jié)果理論上應(yīng)該優(yōu)于其它方法，但是其在實(shí)際應(yīng)用中，并非如此簡(jiǎn)單，較大的和無(wú)法準(zhǔn)確控制的Vu/VS是否也會(huì)影響血漿中NPB藥物濃度的分析還未見(jiàn)報(bào)道，而這些都是

6、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)藥物濃度的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　本課題以PB很小的抗生素-比阿培南(BAN)為代表，研究了在采用CF-UF法分析BAN藥物濃度時(shí)，不同Vu/Vs對(duì)藥物濃度的準(zhǔn)確度影響的理論，兩個(gè)不同濃度的BAN質(zhì)控血漿樣本置于CF-UF裝置中，在1.0×104g離心力下，通過(guò)不同的離心時(shí)間(0.2、1、5、10、20、40和60 min)，得到不同的Vu/Vs，并分別分析其藥物濃度。結(jié)果顯示，隨著Vu/Vs的增加，在Vu/Vs不超過(guò)0.4時(shí)，藥

7、物濃度基本不變，但是當(dāng)Vu/Vs大于0.4時(shí)，藥物濃度會(huì)隨著Vu/Vs的增大而增大。因此，在CF-UF法表征NPB藥物濃度時(shí)，將Vu/Vs控制在0.4以下是準(zhǔn)確分析的一個(gè)關(guān)鍵。但是由于CF-UF方法還無(wú)法準(zhǔn)確控制Vu/Vs，而本課題提出的HFCF-UF裝置，其可以準(zhǔn)確的將Vu/Vs控制在0.08，得到的方法學(xué)結(jié)果更加準(zhǔn)確和精密，成為血漿中NPB藥物濃度分析的一個(gè)適宜平臺(tái)。
　　對(duì)于PB較高的藥物而言，由于其FD濃度比較低，Vu/V

8、s對(duì)準(zhǔn)確度的影響更加明顯，這就需要一個(gè)更加準(zhǔn)確的FD濃度分析方法?？拱d癇藥-丙戊酸鈉(VPA)，其PB為95％，在臨床應(yīng)用中會(huì)出現(xiàn)個(gè)體差異大，毒副反應(yīng)多見(jiàn)的現(xiàn)象。已有研究指出了VPA很有必要以FD濃度進(jìn)行TDM，但是目前在臨床實(shí)踐中仍然以TD作為臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)，這是由于VPA的FD濃度比較低，且需要一個(gè)準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的、不破壞藥物蛋白結(jié)合平衡的FD分離技術(shù)，但是當(dāng)前的分析方法還不能實(shí)現(xiàn)，這就限制了游離的VPA在TDM中的應(yīng)用。本文采用HFCF-

9、UF裝置，建立了游離VPA的分析方法。取0.5mL血漿樣本置于HFCF-UF中，在1.25×103g的離心力下，離心15min，得到濾液40μL，并采用2-溴甲基-2-萘乙酮衍生，進(jìn)行HPLC分析。由于Vu/Vs較小，且可以準(zhǔn)確控制，幾乎不破壞藥物蛋白結(jié)合平衡，分析結(jié)果更加準(zhǔn)確，衍生技術(shù)又明顯提高了檢測(cè)靈敏度，所建方法成功應(yīng)用于VPA的臨床TDM。
　　血漿中水溶性藥物含量分析的樣品前處理技術(shù)常采用萃取法或蛋白沉淀(PPT)法，但

10、是這些方法具有操作步驟多，稀釋樣品等特點(diǎn)，導(dǎo)致方法的靈敏度較低，且回收率通常僅為60％左右，甚至更低。因此，尋求一種無(wú)樣品前處理的直接進(jìn)樣技術(shù)，避免繁瑣的操作，提高方法回收率，是分析工作者研究的一個(gè)熱點(diǎn)。而這些水溶性藥物多是PB較低的藥物，因此可以直接采用HFCF-UF法分析血漿中藥物濃度，達(dá)到樣品零處理的目的。阿莫西林（AMO）是一種半合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，其藥代動(dòng)力學(xué)研究常常以PPT法分析TD濃度，但PPT法需要加入大量沉淀試劑，

11、稀釋血漿樣品而降低檢測(cè)靈敏度，且未沉淀完全的蛋白會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于AMO的PB較低（15％左右），故本課題以AMO為代表，建立了HFCF-UF方法分析血漿中水溶性藥物濃度的直接進(jìn)樣方法。取0.5mL樣本置于HFCF-UF中，在1.25×103 g的離心力下，離心15 min，取超濾液20μL直接進(jìn)行HPLC分析，并與PPT法進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示，兩種方法所得結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HFCF-UF方法操作簡(jiǎn)便、方法學(xué)準(zhǔn)確精密，成功用