CNTN1基因沉默對犬乳腺腫瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)移調(diào)控的影響.pdf

1、CNTN1基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的與癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因，早期的研究表明CNTN1基因和神經(jīng)突觸發(fā)生和發(fā)育有關(guān)，直到2006年Su等首次通過cDNA全基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，至此關(guān)于CNTN1基因在腫瘤方面的作用才被研究者重視。目前為止，CNTN1基因在腫瘤方面的作用機(jī)制仍不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)使用犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm作為實(shí)驗(yàn)材料研究CNTN1基因在犬乳腺腫瘤中轉(zhuǎn)移與侵襲的作用機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)委托吉瑪公司設(shè)

2、計(jì)CNTN1基因shRNA質(zhì)粒，使用脂質(zhì)體2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法將CNTN1 shRNA質(zhì)粒導(dǎo)入犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMm細(xì)胞。采用CCK-8和細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，AnnexinV-ACP/7-AAD凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力，Western blot檢測Akt信號通路相關(guān)蛋白水平變化，探討CNTN1基因沉默后對犬乳腺腫瘤CHMm細(xì)胞及Akt信號通路相關(guān)蛋白影響。
　　結(jié)果:1、熒光顯微鏡下

3、可見中轉(zhuǎn)染CNTN1 shRNA質(zhì)粒的CHMm細(xì)胞存在大量綠色熒光，Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CNTN1 shRNA質(zhì)粒的犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm的CNTN1基因的蛋白表達(dá)量顯著低于對照組(p＜0.05);2、細(xì)胞增殖與凋亡檢測表明，沉默CNTN1的表達(dá)并不影響犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm增殖和凋亡(p＞0.05);3、沉默CNTN1基因表達(dá)細(xì)胞組的PI3K、Akt(Ser473)、和mTOR蛋白的表達(dá)量較對照組組顯著降低(p＜

4、0.05)，但mTOR/p-mTOR蛋白表達(dá)量的比值與對照組無明顯差異(p＞0.05);4、沉默CNTN1基因表達(dá)的細(xì)胞組抑細(xì)胞凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-9蛋白的表達(dá)量較對照組顯著升高(p＜0.05)，促細(xì)胞凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)量較對照組顯著降低(p＜0.05);5、沉默CNTN1基因表達(dá)的細(xì)胞組的細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1蛋白的表達(dá)量較對照組顯著降低(p＜0.05)，p21和p27蛋白的表達(dá)量較

5、對照組顯著升高(p＜0.05);6、沉默CNTN1基因表達(dá)的細(xì)胞組的細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因eNOS蛋白的表達(dá)量較對照組顯著降低(p＜0.05)，E-Cadherin蛋白的表達(dá)量較對照組顯著升高(p＜0.05)。
　　本實(shí)驗(yàn)成功沉默了CHMm表達(dá)的CNTN1基因，沉默效率可達(dá)到60％-70％。CNTN1基因沉默并不影響細(xì)胞的增殖，CNTN1基因沉默可下調(diào)Akt信號通路，從而調(diào)控該通路下游凋亡、周期、轉(zhuǎn)移等蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力