新型陽(yáng)離子磷酸膽堿聚合物MPC30-DEA70載TGF-β1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：心血管重構(gòu)是高血壓、冠心病、心力衰竭的重要病理生理改變，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）及其受體在心肌細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展。
　　 目前反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide， AS-ODN)的基因治療已經(jīng)擁有良好應(yīng)用前景，但是在心血管疾病臨床治療方面尚在積極研究中，本研究旨在用陽(yáng)離子磷酸膽堿聚合物MPC30-DEA70

2、作為運(yùn)載系統(tǒng)，探討MPC30-DEA70能否有效地負(fù)載針對(duì)大鼠TGF-β1基因的AS-ODN(TGF-β1AS-ODN)進(jìn)入心肌細(xì)胞，及對(duì)該基因胞內(nèi)生物表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1．應(yīng)用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atom transfer radicalpolymerization, ATRP)法合成具有高度生物相容性的MPC30-DEA70，并對(duì)材料的溶液性質(zhì)進(jìn)行表征，按不同N/P電荷比值將MPC30-DEA70與T

3、GF-β1AS-ODN絡(luò)合成形成基因復(fù)合物并且對(duì)其總電性進(jìn)行表征。
　　 2．差速貼壁法分離和培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞并利用肌鈣蛋白Ⅰ抗體行免疫熒光(Immunofluorescence technique, IFT)鑒定。
　　 3．采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測(cè)MPC30-DEA70與原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的生物相容性；應(yīng)用熒光顯微鏡(FM)、共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)、透射電子顯微鏡(TEM)觀察M

4、PC30-DEA70（FITC標(biāo)記）及MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN（FAM標(biāo)記）在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位，流式細(xì)胞儀(FCM)、FM檢測(cè)二者的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、熒光強(qiáng)度。
　　 4．免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)、RT-PCR檢測(cè)TGF-β1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．原代培養(yǎng)的細(xì)胞光鏡下呈梭形、不規(guī)則三角形或多角形，核呈卵圓形并居中，搏動(dòng)規(guī)則而且同步，鑒定示純度超過(guò)85％。

5、>　　 2. MPC30-DEA70與心肌細(xì)胞具有較好的細(xì)胞相容性，在較高濃度（＞20μl/ml）下才表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性并呈劑量依賴。
　　 3. MPC30-DEA70及MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN進(jìn)入細(xì)胞后大部分分布于核周，少部分可以進(jìn)入胞核，對(duì)心肌細(xì)胞的超微機(jī)構(gòu)無(wú)明顯影響；對(duì)心肌細(xì)胞均具有較好的轉(zhuǎn)染效率，呈劑量依賴性。
　　 4. MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN在較高N/P