細(xì)胞內(nèi)鈣-縫隙連接因子在針刺預(yù)治療改善缺血性心律失常中的作用.pdf

1、冠心病心肌缺血是世界范圍內(nèi)死亡率最高的疾病之一。而缺血性心律失常,尤其是室性纖顫是大多數(shù)病例心臟停跳而猝死的因?yàn)?。針刺可以改善缺血性心律失?本研究室最近的工作表明,電針預(yù)處理能夠抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心律失常。而有關(guān)針刺預(yù)處理抗缺血性心律失常的機(jī)制,迄今無(wú)人涉足。
　　 最近幾年有關(guān)缺血預(yù)處理的機(jī)制研究也逐步轉(zhuǎn)移到縫隙連接及其連接因子方面。缺血預(yù)處理的保護(hù)作用可能與預(yù)處理使兒茶酚胺釋放減少而降低細(xì)胞內(nèi)鈣,從而抑制缺血引起的C

2、x43去磷酸化和細(xì)胞內(nèi)重新分布。另外,如前述,心肌缺血時(shí)由于交感神經(jīng)興奮、兒茶酚胺釋放,經(jīng)激動(dòng)心肌beta-受體信號(hào)通路而導(dǎo)致鈣超載。采用激動(dòng)該信號(hào)通路不同站點(diǎn)(如采用異丙腎上腺素激動(dòng)beta-受體、采用Forskolin激動(dòng)腺苷酸環(huán)化酶以及采用細(xì)胞外高鈣或鈣通道激動(dòng)劑打開(kāi)鈣通道)的方法都成功模擬了缺血預(yù)處理對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用。由于針刺可以影響交感神經(jīng)的功能,因此針刺預(yù)處理就極有可能通過(guò)心肌beta-受體及其受體后的傳導(dǎo)通路,像缺血預(yù)

3、處理一樣,改善心肌細(xì)胞鈣超載、進(jìn)而改善鈣相關(guān)的Cx43的重塑過(guò)程,包括Cx43的數(shù)量、磷酸化的程度以及Cx43重新分布,最終降低因缺血再灌注導(dǎo)致的心律失常。
　　 本項(xiàng)研究采用結(jié)扎和再灌大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立實(shí)驗(yàn)性心肌局部缺血模型和離體心臟模擬全心缺血(低灌流)模型,首先確定電針預(yù)處理對(duì)缺血性心律失常的療效,并在此基礎(chǔ)上探討細(xì)胞內(nèi)鈣一縫隙連接因子Cx43在介導(dǎo)電針預(yù)治療改善缺血性心律失常中的作用,為針刺改善缺血性心律失常

4、提供分子水平的科學(xué)依據(jù)。此外,針刺預(yù)處理機(jī)制的闡明,也將有助于為采用針灸療法防治該病開(kāi)辟一條新的途徑。
　　 實(shí)驗(yàn)選用雄性成年大鼠Sprague-Dawley(SD)130只,體重215±35g,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、心肌缺血組(IR組)、電針預(yù)治療+心肌缺血組(EA組)、電針預(yù)治療+心肌缺血+Cx43拮抗劑18 beta-glycyrrhetinic acid(EAG)組以及電針預(yù)治療+心肌缺血+鈣通道激動(dòng)劑Bay K

5、8644(EAB)組。EA組于每次麻醉后電針內(nèi)關(guān)30min(電針參數(shù):強(qiáng)度1-3mA,頻率2/15Hz變頻),連續(xù)三天；EAG組和EAB組分別于每次麻醉后先腹腔注射18 beta—glycyrrhetinic acid(160ug/kg)或Bay K8644(9.98ug/kg),30min后再電針內(nèi)關(guān)30min,連續(xù)三天。NC組、IR組僅于每次麻醉后捆綁30min,不做其他處理,連續(xù)三天。
　　 實(shí)驗(yàn)包括三部分內(nèi)容:1電針預(yù)治

6、療對(duì)缺血性心律失常療效的確定；2探討心肌細(xì)胞內(nèi)鈣在電針預(yù)治療改善心肌缺血性心律失常中的作用；3探討縫隙連接因子Cx43重塑機(jī)制在電針預(yù)治療改善心肌缺血性心律失常中的作用。具體結(jié)果如下:
　　 1電針預(yù)治療對(duì)缺血性心律失常療效的確定
　　 采用Cuitis's Scoring System對(duì)各組的心律失常發(fā)生情況進(jìn)行評(píng)定。NC組心律失常評(píng)分為0分,表明NC組在再灌注10min內(nèi)沒(méi)有心律失常發(fā)生；IR組于再灌注10min內(nèi)出

7、現(xiàn)了不同的房性和室性的心律失常,其評(píng)分為3.75±0.25,明顯高于NC組(P<0.05)；經(jīng)電針治療后,EA組評(píng)分為0.75±0.25,與IR組比較,其心律失常發(fā)生率明顯下降(P<0.05)。
　　 2心肌細(xì)胞內(nèi)鈣在電針預(yù)治療改善心肌缺血性心律失常中的作用
　　 2.1電針預(yù)治療對(duì)模擬全心缺血大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣水平的影響
　　 NC組單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度均值是73.67±1.08 nmol/L,而

8、IR組單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度均值為110.42±1.49 nmol/L,明顯高于NC組(P<0.01)；EA組單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度均值為85.42±1.56 nmol/L,與IR組比較,其鈣離子濃度顯著下降(P<0.01)；而當(dāng)每次電針預(yù)治療前給予Cx43拮抗劑-18beta-glycyrrhetinic acid或者鈣通道激動(dòng)劑-Bay K8644時(shí),EAG,EAB兩組單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度均值分別為110.42±

9、1.64 nmol/L,110.833±1.41 nmol/L,均明顯高于EA組(.P<0.01),說(shuō)明Cx43拮抗劑和鈣通道激動(dòng)劑均可以抑制電針預(yù)治療的保護(hù)作用。
　　 2.2電針預(yù)治療對(duì)模擬全心缺血大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞靜息狀態(tài)下鈣振蕩的影響
　　 NC組單個(gè)心肌細(xì)胞發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)為0次,表明NC組在靜息狀態(tài)下10min內(nèi)沒(méi)有鈣振蕩發(fā)生,而IR組于靜息狀態(tài)下10min內(nèi)出現(xiàn)了較為頻繁的鈣振蕩,其次數(shù)為43.83±2.68

10、次,明顯高于NC組(P<0.01)；經(jīng)電針預(yù)治療后,EA組靜息狀態(tài)下發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)明顯下降,其次數(shù)為8.33±1.58次,明顯低于IR組(P<0.01)。而當(dāng)每次電針預(yù)治療前給予Cx43拮抗劑-18 beta-glycyrrhetinic acid或者鈣通道激動(dòng)劑-Bay K8644時(shí),EAG組和EAB組于靜息狀態(tài)下發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)分別為:34±2.11次和48.75±3.34次,此二組發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)均顯著高于EA組(P值均<0.0

11、1)。其結(jié)果表明Cx43拮抗劑和鈣通道激動(dòng)劑均抑制了電針預(yù)治療的保護(hù)作用。
　　 2.3電針預(yù)治療對(duì)模擬全心缺血大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞在電刺激下鈣振蕩的影響
　　 NC組單個(gè)心肌細(xì)胞在電刺激下10分鐘內(nèi)發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)為0次,表明NC組單個(gè)心肌細(xì)胞可以在電場(chǎng)刺激下隨著電刺激的頻率有規(guī)律地收縮,沒(méi)有鈣振蕩的發(fā)生。而IR組單個(gè)心肌細(xì)胞在電場(chǎng)刺激下出現(xiàn)了較為頻繁的鈣振蕩,其次數(shù)為189.42±29.38次,明顯高于NC組(P<0.0

12、1)；經(jīng)電針預(yù)治療后,EA組單個(gè)心肌細(xì)胞在電場(chǎng)刺激下鈣振蕩的次數(shù)明顯下降,其次數(shù)為10.08±3.09次,明顯低于IR組(P<0.01)。與靜息狀態(tài)下類似,當(dāng)每次電針預(yù)治療前給予Cx43拮抗劑-18 beta-glycyrrhetinic acid或者鈣通道激動(dòng)劑-Bay K8644時(shí),EAG組和EAB組單個(gè)心肌細(xì)胞在電場(chǎng)刺激下亦出現(xiàn)了較為頻繁的鈣振蕩,其次數(shù)分別為:125.25±17.24次和289.83±25.98次,均明顯高于EA

13、組(P值均<0.01)。結(jié)果表明,18 beta-glycyrrhetinic acid和Bay K8644抑制了電針預(yù)治療的保護(hù)作用。
　　 3縫隙連接因子Cx43重塑機(jī)制在電針預(yù)治療改善心肌缺血性心律失常中的作用
　　 3.1電針預(yù)治療對(duì)模擬全心缺血大鼠心肌細(xì)胞膜Cx43蛋白總含量的影響
　　 以NC組大鼠心肌細(xì)胞膜上Cx43蛋白總含量作為100％,得到的各組心肌細(xì)胞膜上Cx43蛋白總含量的百分比分別為:IR

14、組82.25±0.02％,EA組83.99±0.02％,EAG組80.52±0.01％,EAB組86.14±0.01％,表明IR、EA、EAG和EAB各組與NC組比較Cx43蛋白總含量有所降低。而IR、EA、EAG和EAB各組大鼠心肌細(xì)胞膜上Cx43蛋白總含量無(wú)明顯變化(P值均>0.05),表明Cx43蛋白含量沒(méi)有參與介導(dǎo)針刺預(yù)治療抗缺血性心律失常的作用。以下需要進(jìn)一步分析Cx43磷酸化狀態(tài)在介導(dǎo)針刺預(yù)治療抗缺血性心律失常的作用。

15、>　　 3.2電針預(yù)治療對(duì)模擬全心缺血大鼠心肌細(xì)胞膜Cx43蛋白磷酸化狀態(tài)的影響
　　 以NC組為100％進(jìn)行比較,IR組非磷酸化的Cx43的含量的百分比為238±0.33％,明顯高于NC組(P<0.05)；其相應(yīng)的磷酸化的Cx43的含量的百分比為42.26±0.03％,明顯低于NC組(P<0.05),經(jīng)電針預(yù)治療后:EA組非磷酸化的Cx43的含量的百分比為108±0.06％,明顯低于IR組(P<0.05)；其相應(yīng)的磷酸化的C

16、x43的含量的百分比為89.21±0.25％,明顯高于IR組(P<0.05)。而EAG組和EAB組與IR組情況類似,兩組非磷酸化的Cx43的含量的百分比分別為:246±0.18％,253±0.16％,均明顯高于EA組(P值均<0.05),此二組相應(yīng)的磷酸化的Cx43的含量百分比分別為:39.26±0.01％和29.28±0.02％:均明顯低于EA組(P值均<0.05)。上述結(jié)果表明,電針預(yù)治療可以減低缺血引起的非磷酸化的Cx43的含量的