赤霉菌侵染后小麥穗部表達(dá)蛋白的差示分析及鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白基因的克隆研究.pdf

1、小麥赤霉病是一種全球性的小麥病害，嚴(yán)重地影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。赤霉病抗性機(jī)理不清楚、遺傳機(jī)制復(fù)雜，這在很大程度上影響了對(duì)小麥赤霉病的控制。因此，小麥赤霉病抗性機(jī)理的研究，無論是對(duì)基礎(chǔ)研究還是對(duì)應(yīng)用研究中都具有重要意義。 蛋白質(zhì)組學(xué)分析是功能基因組學(xué)研究中一種重要的手段，已在遺傳學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本研究以抗赤霉病小麥品種望水白為材料，構(gòu)建了F. graminearum侵染前和侵染后6、12、24小時(shí)小

2、麥穗部蛋白的表達(dá)譜。通過比較侵染前后蛋白表達(dá)水平的變化，得到了117個(gè)在侵染后與侵染前呈現(xiàn)出2倍表達(dá)水平差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并對(duì)其中的30個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析鑒定。其中，烯醇化酶、脂酰CoA還原酶等一系列與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)趨勢；而一些與脅迫應(yīng)答相關(guān)的蛋白，如熱激蛋白、鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白、LRR類似蛋白則表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢。利用中國春缺體-四體材料對(duì)這30個(gè)差異表達(dá)蛋白的基因進(jìn)行了染色體定位研究，將編碼受鐵抑制ABC轉(zhuǎn)錄因子、木葡

3、聚糖-1，4-D-葡萄糖苷酶、磷酸核酮糖激酶、蔗糖-果聚糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶、Mla類似蛋白、dnaK熱激因子70、鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白、jacalin類似蛋白LEM2、β-葡萄糖苷酶、CONSTANS類似蛋白的基因分別定在了小麥2B/3B、6B、2D、4B、1A、5A、5A、2D、7D和3A染色體上。 用RT-PCR的方法，從F. graminearum侵染后6小時(shí)的小麥穗部分離了鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白基因的全長cDNA克隆，并將其命名為TaCRT(

4、Accession no.AAW02798)。該基因編碼一包含415個(gè)氨基酸殘基的多肽，與大麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白基因的相似性達(dá)96％。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)植物鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白間的相似性很高，除了N-domain、P-domain和C-domain三個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域外，還存在著糖基化、豆蔻?；秃硕ㄎ坏缺Ｊ氐幕?，在進(jìn)化上則分成單子葉和雙子葉兩族。染色體定位結(jié)果表明，TaCRT位于小麥染色體5A長臂上；表達(dá)分析結(jié)果表明：TaCRT在不同組織、不同發(fā)育階段

5、表現(xiàn)為組成型表達(dá)，而在BA、高溫、F.graminearum及PA誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡過程中表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢。為進(jìn)一步驗(yàn)證鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白Ca<'2+>結(jié)合特性，構(gòu)建了pET32a-TaCRT-E.coli BL21的原核表達(dá)系統(tǒng)，分離純化表達(dá)的鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白，用偶氮胂Ⅲ法測定得到鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白的平均Ca2+結(jié)合容量為33.3。 為進(jìn)一步研究TaCRT基因在植物抗病反應(yīng)過程中可能的生物學(xué)功能，我們利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，得到了TaCR