S1PR1參與HDL介導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出及其機(jī)制.pdf

1、背景與目的：1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-Phosphate, S1P）是鞘磷脂代謝的中間產(chǎn)物之一。對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。是目前頗受關(guān)注的脂質(zhì)信號(hào)分子，是溶血磷脂的中間代謝物，廣泛存在于血液、淋巴液、紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板等體液和細(xì)胞中，在體內(nèi)具有眾多生物學(xué)作用。S1P的這些作用，或通過(guò)其本身直接產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)，或通過(guò)其特異性受體影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生作用。S1P受體（S1PR）屬

2、于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了它的5種亞型，即S1PR1-5。S1PR1主要與Gi偶聯(lián)，不同的G蛋白介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，因此，S1P與其不同亞型受體作用可以激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生各種各樣的生物學(xué)效應(yīng)。但有關(guān)S1PR1對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的影響未見(jiàn)報(bào)道。因此，本論文主要探討S1PR1參與HDL介導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出及其機(jī)制，為全面了解S1PR1的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制提供

3、新的理論基礎(chǔ)。
　　方法：1.佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞24 h后，選擇不同時(shí)間和濃度的oxLDL進(jìn)行處理，人膽固醇Elisa試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中膽固醇含量。2.分別用50μg/ml HDL、VPC23019(S1PR1抑制劑，10μM)，孵育THP-1源性巨噬細(xì)胞12 h，然后加BODIPY-Cholesterol孵育過(guò)夜，高效液相色譜儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽

4、固醇含量變化，同時(shí)加50μg/ml HDL共孵育，以5μΜ BODIPY熒光標(biāo)記膽固醇細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積變化。3. VPC23019(10μM)、siRNA處理THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h后，Western Blot檢測(cè)ABCA1對(duì)蛋白表達(dá)情況。4.分別用S1P、VPC23019（S1PR1抑制劑）、LY294002（PI3K抑制劑）和MK2206（Akt抑制劑）來(lái)檢測(cè)S1PR1-PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)LXRα表達(dá)的影響。5. T09

5、01317(LXR激動(dòng)劑)、LY294002（PI3K抑制劑）、MK2206（Akt抑制劑）和22S-HC（LXR抑制劑）來(lái)觀察S1PR1-PI3K-Akt-LXRα信號(hào)通路對(duì)ABCA1的表達(dá)影響。6. S1P、siRNA和VPC23019（S1PR1抑制劑）處理THP-1源性巨噬細(xì)胞檢測(cè)S1P/S1PR1對(duì)Akt磷酸化的影響。7.用 oxLDL處理后 THP-1源性巨噬細(xì)胞分別加入：S1P、VPC23019（S1PR1抑制劑）、T09

6、01317（LXRα激動(dòng)劑）和22S-HC（LXRα選擇性抑制劑）檢測(cè)S1PR1和LXRα對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積的影響。
　　結(jié)果：1.60μg/ml oxLDL處理THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h，培養(yǎng)液中膽固醇含量達(dá)到最高。2. THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇大部分位于細(xì)胞胞膜上，HDL可降低THP-1源性巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量；與HDL對(duì)照組相比，S1PR1抑制劑VPC23019使THP-1源性巨噬細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯含量顯著提高

7、，而B(niǎo)ODIPY熒光檢測(cè)結(jié)果示：VPC23019能明顯降低介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，表明S1PR1對(duì)S1P介導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出產(chǎn)生影響。3. S1PR1受體抑制劑VPC23019和siRNA均能顯著降低HDL誘導(dǎo)的ABCA1的蛋白表達(dá)水平。4. S1P、VPC23019、LY294002和MK2206均能不同程度下調(diào)LXRα的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平而S1P確能顯著上調(diào)LXRα的蛋白和mRNA表達(dá)。5. S1PR

8、天然配基S1P和T0901317（LXRα激動(dòng)劑）能顯著增加ABCA1的蛋白和mRNA表達(dá)水平，而LY294002(PI3K抑制劑)， MK2206（Akt抑制劑）和22S-HC（LXRα選擇性抑制劑）能顯著減低ABCA1的蛋白和mRNA表達(dá)水平。6. S1P增加磷酸化Akt水平，而VPC23019和siRNA則使磷酸化Akt水平降低。7. S1P和T0901317（LXRα激動(dòng)劑）能顯著減少THP-1源性巨噬細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯的