Omentin-1對(duì)巨噬細(xì)胞ABCA1介導(dǎo)膽固醇流出及抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis, As）在全球的罹患率以及致死率都名居前列，嚴(yán)重危害人類的健康。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，其標(biāo)志性病理特征是血管內(nèi)皮下大量的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積以及泡沫細(xì)胞的形成。泡沫細(xì)胞最終壞死崩解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的膽固醇，是構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的最主要成分，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)一步進(jìn)展。因此，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出及體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)，從而抑

2、制泡沫細(xì)胞形成和血管壁內(nèi)脂質(zhì)沉積，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性的防治具有重要意義。
　　三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)是一個(gè)膜整合蛋白，其以ATP作為能源將胞內(nèi)游離的膽固醇及磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜的外側(cè)面，最終與貼附在細(xì)胞表面的載脂蛋白AI(apoprotein AI，apoAI)結(jié)合，從而形成新生的高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL

3、）。這是HDL生成所必需的過程，也是促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)過多的膽固醇外流以及RCT的關(guān)鍵步驟。ABCA1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)以及其活性往往受到轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的精細(xì)調(diào)控。
　　網(wǎng)膜素（Omentin）是一類新發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子，主要由網(wǎng)膜脂肪組織表達(dá)和釋放。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)這種基因可調(diào)節(jié)葡萄糖攝取。肥胖或肥胖相關(guān)疾病患者，包括2型糖尿病、內(nèi)皮功能障礙、頸動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈疾病，發(fā)現(xiàn)其血漿Omentin-1水平降低了。研究證明，O

4、mentin-1與高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)呈正相關(guān)，與葡萄糖和甘油三酸酯水平呈負(fù)相關(guān)。代謝綜合征(MetS)初期患者循環(huán)Omentin-1水平異常者其罹患糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高。因此，Omentin-1與代謝綜合征密切相關(guān)，在代謝綜合征患者的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生重要作用。
　　Omentin-1在RCT、脂質(zhì)代謝和As中差異表達(dá)的發(fā)現(xiàn)為我們提供了新的途徑和視角。因此，Omentin-1有望成為心血管保護(hù)因子和干

5、預(yù)靶點(diǎn)之一。然而，Omentin-1在ABCA1表達(dá)及導(dǎo)致提高HDL功能和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用研究尚少。本研究中，我們研究Omentin-1對(duì)巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)的作用和潛在的分子機(jī)制。
　　為了探討Omentin-1抗動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)作用機(jī)制，我們首先在第一部分實(shí)驗(yàn)中觀察Omentin-1對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)、胞內(nèi)膽固醇流出和脂質(zhì)含量的影響。在第二部分實(shí)驗(yàn)中我們探索了Omentin-1介導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞A

6、BCA1表達(dá)及膽固醇流出的作用機(jī)制。接著，我們?cè)诘谌糠謱?shí)驗(yàn)中，觀察了Omentin-1對(duì)apoE-/-小鼠的血脂水平、膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響。最后，我們?cè)诘谒牟糠謱?shí)驗(yàn)中，觀察了具有較強(qiáng)調(diào)脂作用的丹參酮IIA（Tanshinone IIA，Tan）對(duì)巨噬細(xì)胞的Omentin-1和ABCA1的表達(dá)、脂質(zhì)代謝，以及對(duì)apoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響，研究Tan通過上調(diào)Omentin-1發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

7、本研究揭示了Omentin-1抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用以及機(jī)制，也許為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病提供新的防治靶點(diǎn)。
　　第一章、Omentin-1對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)及膽固醇流出的影響
　　目的：觀察Omentin-1對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平、胞內(nèi)膽固醇流出和脂質(zhì)含量的影響。
　　方法：用Omentin-1和/或LXRαsiRNA處理THP-1源性巨噬細(xì)胞后，用RT-PCR方法檢測(cè)各個(gè)實(shí)

8、驗(yàn)組細(xì)胞的ABCA1 mRNA的表達(dá)， Western blot檢測(cè)ABCA1蛋白水平，HPLC檢測(cè)胞內(nèi)總膽固醇(TC)游離膽固醇(FC)及膽固醇酯(CE)含量，液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)胞內(nèi)膽固醇流出，油紅O染色觀察胞內(nèi)脂滴情況。
　　結(jié)果：Omentin-1呈時(shí)間和濃度依賴性上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)，促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇流出，降低胞內(nèi)TC、FC和CE含量，抑制胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成。而ABCA1 siRNA與Omentin-1共處理

9、細(xì)胞后，明顯抑制Omentin-1促膽固醇流出的作用，胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成明顯加劇。
　　結(jié)論：
　?。?）Omentin-1增加THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)。
　?。?）Omentin-1促進(jìn)ABCA1介導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)流出，抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成。
　　第二章、Omentin-1介導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)及膽固醇流出的作用機(jī)制
　　目的：探索O

10、mentin-1介導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)及膽固醇流出的作用機(jī)制。
　　方法：分別用Omentin-1或和LXRα siRNA、PI3K siRNA、Akt siRNA、PI3K抑制劑LY2940029及Akt抑制劑HIMO處理THP-1源性巨噬細(xì)胞24h后，Western blot檢測(cè)ABCA1 LXRα蛋白水平，HPLC檢測(cè)胞內(nèi)總膽固醇(TC)游離膽固醇(FC)及膽固醇酯(CE)含量，液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)胞內(nèi)膽固醇流出

11、，油紅O染色觀察胞內(nèi)脂滴情況。
　　結(jié)果：Omentin-1上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)，促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇流出，降低胞內(nèi)TC、FC和CE含量，抑制胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成。而分別加用LXRαsiRNA、PI3K siRNA、Akt siRNA、PI3K抑制劑LY2940029及Akt抑制劑HIMO與Omentin-1共處理細(xì)胞后，明顯抑制ABCA1的表達(dá)及其促膽固醇流出的作用，胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成明顯加劇。
　　結(jié)論：

12、Omentin-1通過PI3K/Akt途徑增加人THP-1巨噬細(xì)胞LXRα和ABCA1表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)流出，抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成。
　　第三章、Omentin-1對(duì)apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響
　　目的：探討Omentin-1對(duì)apoE-/-小鼠體內(nèi)RCT、血脂水平、主動(dòng)脈壁的脂質(zhì)沉積，以及對(duì)粥樣硬化病變的影響和機(jī)制。
　　方法：采用高脂飲食（含15％豬油+0.25%膽固醇）喂飼的45只apoE-

13、/-小鼠，并隨機(jī)地分為三組，分別為：高脂對(duì)照組、Omentin-1組、Omentin-1+LY2940029組。Omentin-1組腺病毒轉(zhuǎn)染Omentin-1以1×108 PFU/kg(PFU:空斑形成單位)，Ome+LY組小鼠再加以20mg/kg PI3K抑制劑LY2940029，溶入0.2ml的生理鹽水中進(jìn)行尾靜脈注射，每2周注射一次，都用基礎(chǔ)飲食加上高脂高膽固醇（15%豬油+0.25%膽固醇）喂養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共處理8周。采用

14、液體閃爍計(jì)數(shù)以測(cè)定MPM來源的RCT效率；采用酶氧化法檢測(cè)甘油三酯（TG）、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）等血脂水平；采用蘇丹Ⅳ染色以顯示主動(dòng)脈內(nèi)膜的As病變情況；采用HE染色顯示主動(dòng)脈竇的As病變情況；采用油紅O染色以觀察主動(dòng)脈竇處脂質(zhì)沉積的情況；采用Masson三色染色以顯示斑塊中的膠原纖維；采用Western blot檢測(cè)小鼠的主動(dòng)脈ABCA1 等蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果

15、：輸注了轉(zhuǎn)染Omentin-1的質(zhì)粒明顯增強(qiáng)了apoE-/-小鼠糞便中3H固醇的放射活性，并增高血漿的HDL-c水平，降低了LDL-c水平，使主動(dòng)脈內(nèi)膜的As病變面積減小，減少主動(dòng)脈竇處的脂質(zhì)沉積，增強(qiáng)As斑塊的穩(wěn)定性，增加了主動(dòng)脈ABCA1的蛋白表達(dá)。注射LY2940029則明顯減少糞便中的固醇水平，增加主動(dòng)脈壁內(nèi)脂質(zhì)沉積，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展，下調(diào)ABCA1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　（1）Omentin-1促進(jìn)a

16、poE-/-鼠體內(nèi)RCT和升高血漿HDL-c水平。
　?。?）Omentin-1抑制apoE-/-鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積，延緩粥樣硬化病變的進(jìn)展。
　?。?）Omentin-1增強(qiáng)apoE-/-鼠主動(dòng)脈壁組織的ABCA1表達(dá)，并且其可能是通過PI3K/Akt信號(hào)通路而起調(diào)節(jié)作用的。
　　第四章、丹參酮IIA對(duì)巨噬細(xì)胞Omentin-1/ABCA1水平及apoE-/-小鼠主動(dòng)脈病變的影響及其機(jī)制
　　目的：觀察丹參酮II

17、A（Tanshinone IIA，Tan）對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞中Omentin-1和ABCA1表達(dá)，以及對(duì)apoE-/-小鼠體內(nèi)血脂水平、RCT、主動(dòng)脈壁As病變的影響，并探討Tan抗As的作用機(jī)制。
　　方法：用Tan處理THP-1巨噬細(xì)胞，并結(jié)合Omentin-1siRNA轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR以檢測(cè)Omentin-1和ABCA1水平，采用western blot檢測(cè)Omentin-1和ABCA1蛋白

18、表達(dá)；采用液體閃爍計(jì)數(shù)以測(cè)定荷脂THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流出情況，采用HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的含量。高脂飲食（含15%豬油+0.25%膽固醇）喂飼的45只apoE-/-小鼠被隨機(jī)分為三組，分別為：高脂對(duì)照組、丹參酮IIA組和丹參酮IIA+Omentin-1 siRNA組。采用液體閃爍計(jì)數(shù)以測(cè)定MPM來源的RCT效率，采用酶氧化法以檢測(cè)TG、TC、HDL-c和LDL-c等的血脂水平，采用蘇丹Ⅳ染色以顯示主動(dòng)脈內(nèi)膜的As病變情況，采用H

19、E染色以顯示主動(dòng)脈竇As病變情況，采用油紅O染色以顯示主動(dòng)脈竇處脂質(zhì)的沉積情況，采用Masson三色染色以顯示As斑塊中的膠原纖維情況。
　　結(jié)果：觀察到Tan可以呈劑量和時(shí)間依賴性地增強(qiáng)了THP-1巨噬細(xì)胞中Omentin-1和ABCA1蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，并減少細(xì)胞內(nèi)的FC、CE和TC含量。Tan可增強(qiáng)apoE-/-小鼠糞便中3H膽固醇的放射活性，并增高血漿HDL-c水平，降低LDL-c水平，增強(qiáng)主動(dòng)脈Oment