Siglec-1介導(dǎo)巨噬細胞炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化發(fā)病中的研究.pdf

1、研究背景：動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機制至今尚未闡明。近年來認為免疫炎癥特別是由巨噬細胞介導(dǎo)的天然免疫在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Siglec-1（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin1，唾液酸黏附素，又名CD169）作為單核巨噬細胞激活的重要標志，在SLE、系統(tǒng)性硬化、HIV 感染等自身免疫性疾病和炎癥性疾病外周血

2、及病變組織表達增高，并參與分泌細胞因子和激活T淋巴細胞等過程。但其在冠心病發(fā)病過程中的作用還不清楚。
　　 目的：本研究擬通過外周血分析、體外細胞培養(yǎng)和體內(nèi)動物實驗三個層次，研究siglec-1在冠心病患者中的表達及其在AS 發(fā)病過程中的作用，探討siglec-1作為評價疾病活動性的指標或作為潛在治療靶點的價值。
　　 方法：
　　 （1外周血表型分析a) 流式細胞儀檢測冠心病病人和正常對照組外周血單核細胞CD1

3、4CD169 雙陽性細胞比例。
　　 B)分離外周血單個核細胞，抽提總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA, 實時熒光相對定量PCR 檢測siglec-1mRNA表達情況。
　　 C) 根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果，計算冠心病病人冠狀動脈狹窄程度評分Gensini Score，并與siglec-1表達作相關(guān)性分析。
　　 D) 檢測冠心病危險因子超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和同型半胱氨酸(HCY)，并與siglec-1表達作相關(guān)性

4、分析。
　　 （2 體外細胞培養(yǎng)a) 體外培養(yǎng)RAW264.7 巨噬細胞株及原代小鼠骨髓巨噬細胞。
　　 B) 各種刺激劑如ox-LDL、M-CSF、INF-α等刺激巨噬細胞siglec-1高表達；小干擾RNA 或抗體阻斷技術(shù)抑制siglec-1表達。
　　 C) 觀察各組巨噬細胞分泌趨化因子MCP-1、MIP-1alpha、MIP-2和吞噬ox-LDL的能力。
　　 D) 磁珠分選外周血CD4+、CD8

5、+、CD14+細胞，單核細胞（CD14+）和淋巴細胞（CD4+、CD8+）混合培養(yǎng)觀察單核細胞siglec-1抑制和表達增強后刺激CD4+和CD8+T淋巴細胞增殖和分泌細胞因子的變化。
　　 （3 動物實驗a) 高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬化模型。
　　 B)構(gòu)建帶siglec-1小干擾序列的慢病毒載體和對照病毒載體，尾靜脈注射小鼠，靶向敲除siglec-1后再高脂喂養(yǎng)4個月，觀察小鼠粥樣斑塊形成。
　

6、　 C)免疫組化觀察粥樣斑塊中CD4+T細胞、CD8+T細胞及巨噬細胞數(shù)量。
　　 D) 熒光定量PCR 檢測主動脈IL-1、TNF-α炎性細胞因子分泌情況。
　　 結(jié)果：
　　 （1外周血表型分析a) 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，Siglec-1在正常對照組及冠心病組淋巴細胞和中性粒細胞上均無表達；冠心病組單核細胞CD14CD169 雙陽性率為 (11.53.9)％，顯著高于健康對照組的陽性率[(1.82.0)％，P

7、<0.01]。
　　 B) 冠心病組Siglec-1mRNA的平均拷貝數(shù)顯著高于健康對照組，為健康對照組的3.17倍；而冠心病血脂正常組和血脂異常組的Siglec-1陽性率和mRNA平均拷貝數(shù)均無明顯差異。
　　 C) 冠心病患者siglec-1mRNA表達和冠心病嚴重程度評分Gensini Score及炎癥活動指標hs-CRP、HCY 三者成正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r和p值分別為：r=0.338, P=0.015; r=0.3

8、16,P=0.016; r=0.224, P=0.042)。
　　 （2 體外細胞培養(yǎng)a) 各種刺激劑如ox-LDL、M-CSF、INF-α等能有效刺激巨噬細胞siglec-1高表達；
　　 小干擾RNA 或抗體阻斷能特異性抑制siglec-1表達。
　　 B) siglec-1高表達后可以明顯促進巨噬細胞MCP-1、MIP-1alpha及MIP-2的分泌和吞噬ox-LDL，而siglec-1表達降低后上述作用逆

9、轉(zhuǎn)。
　　 C) 冠心病患者外周血CD14+單核細胞比正常人單核細胞具有更強的刺激T細胞增殖和促炎性細胞因子分泌的作用。當(dāng)用INF-α上調(diào)正常人單核細胞siglec-1表達后，單核細胞刺激CD4+和CD8+T細胞增殖能力增強，刺激CD4+T細胞促炎性細胞因子（IL-2、IL-12、INF-γ）分泌能力增強，抗炎性細胞因子（IL-10）分泌減弱，并且這種作用可通過siRNA 或抗siglec-1單抗靶向阻斷而逆轉(zhuǎn)。
　　

10、（3 動物實驗a)小干擾siglec-1組比對照病毒組動脈粥樣斑塊形成緩慢，斑塊面積占動脈總面積分別為(14.043±1.342)％和 (33.487±2.715)％，p<0.001。
　　 B)小干擾siglec-1組比對照病毒組粥樣斑塊中CD4+T細胞、CD8+T細胞及巨噬細胞浸潤數(shù)量少；IL-1、TNF-α炎性細胞因子分泌能力低（分別為0.2646±0.0387vs. 1.0032±0.0969, p<0.001和0.18

11、20±0.0193vs. 1.0119±0.1964, p<0.01)。
　　 結(jié)論：siglec-1作為一種反映冠心病嚴重程度和炎癥活動性的無創(chuàng)性指標，在ox-LDL等刺激下表達增高，參與巨噬細胞吞噬ox-LDL，演變成泡沫細胞，并激活巨噬細胞，分泌MIP-1alpha、MCP-1和IL-8等趨化因子，募集更多巨噬細胞和淋巴細胞到粥樣斑塊，并參與激活CD4+/CD8+T淋巴細胞，參與粥樣斑塊中的炎癥反應(yīng)。靶向抑制siglec-