HCMV與THP-1源性巨噬細(xì)胞AIM2炎性體的相互作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.證實(shí)HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后可被AIM2識(shí)別，誘導(dǎo)AIM2炎性體活化；
　　2.應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，研究HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞所致炎性體相關(guān)分子事件，以明確HCMV誘導(dǎo)的炎性體活化是否依賴AIM2蛋白；
　　3.探索HCMV被膜蛋白pUL83與AIM2蛋白之間的相互作用；
　　4.明確pUL83-AIM2相互作用對(duì)AIM2炎性體通路的影響。
　　方法：
　　

2、一、HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)AIM2炎性體活化
　　1. PMA(100 ng/ml)刺激培養(yǎng)THP-1細(xì)胞24 h獲得THP-1源性巨噬細(xì)胞；
　　2. HCMV AD169毒株感染 THP-1源性巨噬細(xì)胞（MOI=1)后1h、3h、6h、12h、24 h、48 h和96 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立模擬感染對(duì)照組；poly(dA:dT)(1g/ml)轉(zhuǎn)染THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h作為陽(yáng)性對(duì)照組；

3、　　3.取各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1p和IL-18濃度以評(píng)估AIM2炎性體活化狀態(tài)；應(yīng)用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)LDH含量以評(píng)估細(xì)胞死亡情況；
　　4.收集感染后1h、6h、24h各組細(xì)胞，提取總蛋白，應(yīng)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCMV感染后AIM2與ASC蛋白的結(jié)合。
　　二、AIM2基因沉默對(duì)HCMV誘導(dǎo)的炎性體活化和病毒基因轉(zhuǎn)錄的影響
　　1.應(yīng)用AIM2特異性siRNA轉(zhuǎn)染THP-1源性巨噬細(xì)

4、胞72 h，得到AIM2沉默的巨噬細(xì)胞（S+)，同時(shí)用無(wú)關(guān)siRNA(Stealth negative control L O G C)轉(zhuǎn)染THP-1源性巨噬細(xì)胞，得到模擬沉默對(duì)照細(xì)胞（S-); HCMV AD169毒株分別感染S+和 S-(MOI=1)，即S+/V+和 S-/V+，同時(shí)設(shè)立模擬感染對(duì)照組，即S+/V-和S-/V-;
　　2.感染/模擬感染1 h、6 h、24 h后收集四組細(xì)胞總蛋白，采用Western-blot檢

5、測(cè)AIM2、pro-caspase-1、p10(活化caspase-1片段）、pro-IL-ip和IL-1p的蛋白表達(dá)水平；
　　3.感染1 h、3 h、6 h、12 h和24 h后收集V+組細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-ip和IL-18濃度；應(yīng)用L D H檢測(cè)試劑盒檢測(cè)L D H含量；
　　三、HCMV被膜蛋白pUL83與人AIM2蛋白的相互作用
　　1.登陸NCBI GenBank網(wǎng)站，查詢HCMV

6、 AD169毒株UL83基因序列和人源AIM2基因序列，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增全序列的特異性引物以擴(kuò)增兩個(gè)目的基因；
　　2.應(yīng)用In-fusion技術(shù)將目的基因UL83和AIM2分別插入到p M載體和pVP16載體中，得到pM-UL83和pVP-AIM2重組表達(dá)載體，理論上可分別表達(dá)D N A BD-pUL83和AD-AIM2重組蛋白；
　　3.應(yīng)用鈣轉(zhuǎn)染法將pM-UL83和pVP-AIM2轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，72 h后收集

7、細(xì)胞提取總蛋白，應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)兩個(gè)重組表達(dá)載體的表達(dá)情況；
　　4.應(yīng)用鈣轉(zhuǎn)染法將pM-UL83、pVP-AIM2和分泌型堿性磷酸酶（SEAP)報(bào)告基因一同轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)上清中SEAP濃度；提取細(xì)胞蛋白應(yīng)用免疫共沉淀法檢測(cè)兩重組蛋白的結(jié)合；
　　四、pUL83與AIM2蛋白結(jié)合對(duì)AIM2炎性體通路的影響
　　1.登陸NCBIGen

8、Bank網(wǎng)站，查詢?nèi)嗽碅SC、 caspase-1和IL-ip基因，設(shè)計(jì)合成全序列特異性引物以擴(kuò)增目的基因。應(yīng)用In-fusion技術(shù)將ASC、caspase-1和IL-ip基因（保留終止密碼子）分別插入到pDsRed-N1載體中，理論上，三個(gè)重組載體分別表達(dá)ASC、pro-caspase-1和pro-IL-ip蛋白；
　　2.將pVP-AM2和ASC、caspase-：l和IL-ip重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，命名

9、為rHEK293T細(xì)胞，72 h后應(yīng)用Western-blot檢測(cè)AIM2、ASC、pro-caspase-1和pro-IL-ip蛋白的表達(dá)；
　　3. poly(dA:dT)轉(zhuǎn)染rHEK293T6 h和24 h后提取細(xì)胞總蛋白；p M-U L83重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染rHEK293 T細(xì)胞后轉(zhuǎn)染poly(dA:dT)6 h和24 h后提取細(xì)胞總蛋白。Western-blot檢測(cè) AIM2、ASC、pro-caspase-1、p10、p

10、ro-IL-ip和IL-ip的蛋白水平；
　　4. ASC、caspase-1和 IL-ip重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至H E K293 T細(xì)胞中，命名為rHEK293T( AIM2-)細(xì)胞，重復(fù)方法3中的實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　一、HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)AIM2炎性體活化
　　1. HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后，IL-1p和 IL-18釋放量隨著感染時(shí)間的推移而增加，前者自感染后12 h起明顯高

11、于感染前水平，后者在感染48 h后明顯高于感染前水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；感染組LDH含量在感染后3h，48h和96h時(shí)較模擬感染組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　2.在HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后1?24h期間，AIM2與ASC蛋白相結(jié)合。
　　二、AIM2基因沉默抑制HCMV誘導(dǎo)的炎性體活化和病毒基因轉(zhuǎn)錄
　　1. AIM2蛋白：S-細(xì)胞感染HCMV后6h，AIM2蛋白含量較感染前明顯升高，感染后24 h下降；

12、S+細(xì)胞中幾乎無(wú)AIM2蛋白表達(dá)；
　　2. caspase-1前體與活化片段p10: pro-caspase-1在各組細(xì)胞中較穩(wěn)定表達(dá)；V-組細(xì)胞無(wú)p10表達(dá)；S-細(xì)胞在感染HCMV后1h可檢測(cè)到少量p10，6?24 h該片段表達(dá)顯著增加；S+細(xì)胞在感染后1?6 h內(nèi)無(wú)p10表達(dá)，感染后24 h可檢測(cè)到該片段，但顯著低于同時(shí)間點(diǎn)S-細(xì)胞的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　3. I L-1β前體與成熟IL-1β: S-和 S

13、+細(xì)胞感染HCMV后1 h，pro-IL-1β表達(dá)量均顯著增加并持續(xù)至感染后6 h，但在感染后24 h，S-細(xì)胞顯著下降，S+細(xì)胞稍有下降;S-細(xì)胞的IL-1β于感染后1 h開(kāi)始增加，持續(xù)至24 h;而S+細(xì)胞的IL-1β在感染后1 h和6 h相當(dāng)于感染前水平，感染后24 h時(shí)該蛋白才表達(dá)增加，但顯著低于同時(shí)間點(diǎn)S-細(xì)胞的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　三、HCMV被膜蛋白pUL83與細(xì)胞AIM2蛋白發(fā)生相互作用
　　1.

14、 pM-UL83和pVP-AM2重組表達(dá)載體構(gòu)建成功且可在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)；
　　2.雙雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到pM-UL83、pVP-AIM2和SEAP報(bào)告基因在共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后SEAP含量顯著增加；
　　3.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到pM-UL83和 pVPAM2的表達(dá)產(chǎn)物DNABD-pUL83和AD-AIM2蛋白發(fā)生相互作用；
　　4.免疫共沉淀檢測(cè)到HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后6-12 h，pUL83

15、蛋白同AIM2蛋白發(fā)生相互作用。其中，12 h時(shí)相結(jié)合的蛋白較多；免疫熒光共定位檢測(cè)到二者共定位于胞質(zhì)中；
　　四、pUL83通過(guò)結(jié)合AIM2蛋白下調(diào)AIM2炎性體通路
　　1.成功構(gòu)建ASC、 caspase-1和IL-1β重組表達(dá)載體；Western-blot檢測(cè)到rHEK293T細(xì)胞可以表達(dá)AIM2、ASC、pro-caspase-1和pro-IL-1β蛋白；
　　2. poly(dA:dT)轉(zhuǎn)染rHEK293

16、T細(xì)胞后，pro-IL-ip蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染前明顯增加， caspase-1活化片段p10以及成熟I L-1β出現(xiàn)；p M-U L83重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染rHEK293T細(xì)胞后再轉(zhuǎn)染poly(dA:dT)時(shí)，pUL83蛋白高表達(dá)，然而 AIM2、pro-caspase-1、pro-IL-ip、p10和成熟IL-1β蛋白水平較轉(zhuǎn)染pM-U L83前大幅度減少，ASC蛋白量也有所降低；
　　3. poly(dA:dT)在有或無(wú)pUL83表

17、達(dá)的情況下轉(zhuǎn)染rHEK293T(AIM2-)細(xì)胞，ASC、pro-caspase-1和pro-IL-ip蛋白水平無(wú)變化，且與轉(zhuǎn)染前水平相當(dāng)；均無(wú)p10和成熟IL-ip蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1. HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后誘導(dǎo)AIM2炎性體組裝，促進(jìn)成熟IL-1β和IL-18釋放和細(xì)胞死亡；
　　2. AIM2蛋白是介導(dǎo)HCMV感染早期誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性體活化的必要感受器；
　　3. AIM2炎性體活