甲基原薯蕷皂苷對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響.pdf

1、[目的]
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是大多數(shù)心腦血管疾病發(fā)生的前期病理基礎，在AS發(fā)生發(fā)展過程中，巨噬細胞來源的泡沫細胞形成是動脈粥樣損傷形成的特征性改變，促進細胞內膽固醇和膽固醇酯的流出是調節(jié)巨噬細胞膽固醇動態(tài)平衡的關鍵環(huán)節(jié)。膽固醇以囊泡分泌途徑進行轉運已得到公認，而在此過程中有高密度載脂蛋白apoA-1的介導。甲基原薯蕷皂苷(methyl protodioscin，MPD)是一種重要的甾體皂苷

2、，臨床研究表明MPD可降低血漿總膽固醇含量、升高血漿HDL膽固醇水平，通過調節(jié)氧化應激和脂質成分改善高膽固醇血癥和AS，但其作用機制尚未闡明。本實驗擬分析MPD對apoA-1介導的泡沫細胞內膽固醇流出的影響，并對其作用機制進行初步研究。
　　 [方法]
　　 1.巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立。人急性單核細胞型白血病細胞（THP-1細胞）用160 nM佛波酯(phorbol-1-myristate-13-acetate，

3、PMA)作用24 h誘導分化為貼壁巨噬細胞，再加入50μg/ml乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein，Ac-LDL)孵育48h誘導分化為泡沫細胞。
　　 2.巨噬細胞源性泡沫細胞模型的鑒定。泡沫細胞用4％多聚甲醛固定，經0.5％油紅O染色、蘇木精復染后，置相差顯微鏡下觀察結果。用0.1％TritonX-100裂解巨噬細胞和泡沫細胞，分別加入0.4 U/ml膽固醇酯酶和0.4 U

4、/ml膽固醇氧化酶將樣品中的游離膽固醇和膽固醇酯全部轉化為膽甾烯酮，以標準膽甾烯酮作為外標，高效液相色譜(HPLC)檢測各組峰面積，根據(jù)蛋白濃度計算游離膽固醇和總膽固醇含量。
　　 3.液體閃爍計數(shù)法測定泡沫細胞內膽固醇流出率。0.5μCi[3H]-膽固醇與50μg/ml Ac-LDL混勻、室溫靜置10 min，加入PMA誘導的巨噬細胞中作用48 h后，用空白培養(yǎng)基平衡24 h(同時MPD組加入0.1 mg/ml MPD作用24

5、h)，再加入10μg/ml apoA-1作用24 h后收集各組培養(yǎng)基，0.1 M NaOH裂解各組細胞，液體閃爍計數(shù)儀測定各組培養(yǎng)基和細胞的cpm值（cpm值為[3H]-膽固醇放射強度，每分鐘計數(shù)）。膽固醇流出率(％)=培養(yǎng)基內cpm/(培養(yǎng)基內cpm+細胞內cpm)×100。
　　 4.ABCA1、SREBP1和SREBP2 mRNA和蛋白表達變化分析。THP-1細胞經PMA、Ac-LDL誘導分化為泡沫細胞后，分為Ac-LDL

6、組、apoA-1組和MPD組，根據(jù)ABCA1、SREBP1和SREBP2在GeneBank中的序列設計合成引物，提取細胞總RNA、逆轉錄，實時定量PCR檢測mRNA水平的變化。裂解各組細胞收集總蛋白，SDS-PAGE電泳分離、電轉移后，加入特異性抗體，Western blot檢測ABCA1、SREBP1和SREBP2蛋白表達變化。
　　 [結果]
　　 1.油紅O染色鑒定巨噬細胞源性泡沫細胞模型。50tg/ml Ac-L

7、DL作用于巨噬細胞48 h，0.5％油紅O染色后，鏡下可觀察到細胞核被染成藍色，胞漿內有大量紅色脂滴形成，胞漿呈泡沫狀改變。
　　 2.HPLC法鑒定巨噬細胞源性泡沫細胞模型。根據(jù)標準品膽甾烯酮濃度、峰面積和樣品蛋白濃度、峰面積計算可得:泡沫細胞內游離膽固醇含量為6.52±0.42 mg/g細胞蛋白、總膽固醇含量為16.05±1.05 mg/g細胞蛋白，膽固醇酯含量為9.53±0.98 mg/g細胞蛋白（總膽固醇含量-游離膽固醇

8、含量）。與對照巨噬細胞相比，泡沫細胞內膽固醇酯占總膽固醇含量的（59.4±3.3）％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 3.液體閃爍計數(shù)法測定泡沫細胞內膽固醇流出率。與apoA-1組相比，MPD處理組膽固醇流出率為（14.08±1.27）％，增加了（38.3±8.1）％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明MPD可明顯促進泡沫細胞內膽固醇流出。
　　 4.實時定量PCR檢測ABCA1、SREBP1和SREBP2

9、 mRNA水平變化，結果顯示與apoA-1組相比，MPD處理組ABCA1 mRNA表達水平提高了39.6％，SREBP1 mRNA表達水平降低了43.2％、SREBP2 mRNA表達水平降低了42.3％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 5.Western blot分析ABCA1、SREBP1和SREBP2蛋白表達變化，其結果與mRNA水平變化具有一致性。與apoA-1組相比，MPD處理組ABCA1蛋白水平表達量增加了4