人永生化肝細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究及Prohibitin1上調(diào)與肝癌關(guān)系的研究.pdf

1、第一部分 人永生化肝細(xì)胞糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究 本論文提出一種用于大規(guī)模分離和鑒定人永生化肝細(xì)胞(Chang liver細(xì)胞)的N-糖基化糖蛋白的方法。為了從細(xì)胞裂解物中高通量地分離N-糖基化糖蛋白，我們先對(duì)Chang liver細(xì)胞進(jìn)行裂解、細(xì)胞總蛋白溶解以及凝集素親和層析(包括ConcanavalinA (Con A)和wheat germ agglutinin (WGA))，再利用雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional

2、 gel electrophoresis，2-DE)對(duì)于被凝集素吸附的糖蛋白進(jìn)行分離，最后利用質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry，MS)進(jìn)行鑒定。圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過ImageMaster<'TM> 2-DPlatinum軟件分析，Chang liver細(xì)胞中的蛋白質(zhì)經(jīng)Con A吸附后平均檢測(cè)到323±5(n=3)個(gè)蛋白點(diǎn)；經(jīng)WGA吸附后平均檢測(cè)到256±5(n=3)個(gè)蛋白點(diǎn)。去除重疊的124±5(n=3)個(gè)蛋白點(diǎn)后，共吸附455個(gè)不

3、同的蛋白點(diǎn)。對(duì)于從Chang liver細(xì)胞裂解物中吸附的糖蛋白，我們從考馬斯染色的電泳膠上切點(diǎn)后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共鑒定了84個(gè)蛋白點(diǎn)，其中47個(gè)蛋白點(diǎn)是Con A吸附的糖蛋白，代表40個(gè)不同的蛋白質(zhì)；37個(gè)蛋白點(diǎn)是WGA吸附的糖蛋白，代表34個(gè)不同的蛋白質(zhì)。去除Con A和WGA都有吸附的點(diǎn)后，共得到70個(gè)不同的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，我們建立了一種高通量的糖蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分離人肝細(xì)胞的N-糖基化糖蛋白。本文的研究?jī)?nèi)容是人類肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研

4、究項(xiàng)目(HUMAN LIVER PROTEOME PROJECT(HLPP))的一部分，這種方法的建立將有助于促進(jìn)人類對(duì)肝臟細(xì)胞N-糖基化糖蛋白的研究。 第二部分 人永生化肝細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞的比較糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究 應(yīng)用第一部分的方法，我們對(duì)比了Chang liver細(xì)胞和人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-H的N-糖基化糖蛋白表達(dá)差異，分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)在MHCC97-H細(xì)胞中上調(diào)的糖蛋白(p<0.05)，其中2個(gè)是Con A吸

5、附的糖蛋白，5個(gè)是WGA吸附的糖蛋白，并通過質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行了鑒定。鑒定結(jié)果表明，Con A吸附的糖蛋白分別為羧酸酯酶(Carboxylesterase)和熱休克蛋白96前體(Heat shock protein gp96 precursor)，WGA吸附的糖蛋白分別為抑制素(Prohibitin 1，PHB)、谷氨酸一半胱氨酸連接酶修飾亞基(Glutamate-cysteine ligase，modifier subunit

6、)、假定蛋白(Hypotheticalprotein)、類似B細(xì)胞增強(qiáng)因子的新蛋白(Novel protein similar to Pre-B cellenhancing factor，PBEF)和二氫硫辛酰氨脫氫酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase，E3 component of pyruvate dehydrogeilase complex， 2-oxo-glutarate com)。研究報(bào)道表明這些糖

7、蛋白與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有一定的聯(lián)系。 第三部分Prohibitin 1上調(diào)與肝癌增殖及遷移關(guān)系的研究 在第二部分的研究結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)prohibitin 1(PHB)在MHCC97-H細(xì)胞中明顯上調(diào)。盡管PHB早被報(bào)道為一種腫瘤抑制蛋白，但尚未發(fā)現(xiàn)它與腫瘤的關(guān)系及其糖基化的報(bào)道，所以我們選擇PHB作為對(duì)象進(jìn)一步研究PHB上調(diào)與肝癌的關(guān)系。首先我們對(duì)糖蛋白質(zhì)組學(xué)得到的PHB在肝癌細(xì)胞中的上調(diào)進(jìn)行驗(yàn)證。通過Western

8、blot和半定量RT-PCR兩種方法證明了PHB表達(dá)量在肝癌細(xì)胞MHCC97-H細(xì)胞中比Chang liver細(xì)胞上調(diào)約2倍。同時(shí)我們還通過Western blot比較了4個(gè)肝癌病人的正常、癌旁和肝癌組織(pair，test p<0.01)的PHB表達(dá)量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩例病人的肝癌組織中PHB的表達(dá)明顯調(diào)(p<0.05)。其次，為了研究PHB與肝癌的關(guān)系，我們選擇其他肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、BEL-7404、HuH-7、Lmb

9、、MHCC97-L細(xì)胞，對(duì)其中PHB的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除MHCC97-H細(xì)胞外，其他肝癌細(xì)胞中PHB的表達(dá)量均沒有明顯上調(diào)，尤其是MHCC97-L細(xì)胞中PHB的表達(dá)量明顯低于MHCC97-H細(xì)胞。MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞是具有相同遺傳背景但轉(zhuǎn)移潛能不同的細(xì)胞，所以我們下一步進(jìn)行PHB與肝癌細(xì)胞遷移的關(guān)系的研究。我們通過構(gòu)建PHB表達(dá)質(zhì)粒，在MHCC97-L細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PHB表達(dá)質(zhì)粒而使PHB過表達(dá)，然后對(duì)過表

10、達(dá)PHB的MHCC97-L細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的MHCC97-L的增殖、遷移能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，PHB在MHCC97-L細(xì)胞中過表達(dá)對(duì)MHCC97-L細(xì)胞的增殖抑制率為35％，而細(xì)胞的遷移率增加了2.1±0.1倍(p<0.05)倍。最后，我們利用SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)、免疫共沉淀和凝集素L-PHA印跡驗(yàn)證PHB是一種糖蛋白。我們的結(jié)果第一次報(bào)道了PHB蛋白是一種N-糖基化糖蛋白，且參與肝癌細(xì)胞的增殖和遷移的調(diào)控。 綜上所