正常人肝組織及肝癌相關(guān)WGA親和型糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、蛋白質(zhì)糖基化作為一種重要的翻譯后修飾對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，如對蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸、定位和功能表達(dá)起著重要的作用。許多疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。目前，糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究熱點(diǎn)主要集中于表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和比較/差異糖蛋白質(zhì)組學(xué)。至今沒有一個(gè)完整數(shù)據(jù)庫全面闡述正常生理狀態(tài)下所有糖基化的蛋白質(zhì)，也未見有系統(tǒng)的糖蛋白質(zhì)組學(xué)手段篩查病理過程相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)。肝癌的血清糖蛋白中有許多糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如：唾液酸增多、N-乙酰氨基乳糖重復(fù)順序出

2、現(xiàn)、平分型GIcNAc增加等。本研究利用麥胚凝集素(WGA)能夠特異性識別帶有唾液酸的聚糖或帶有平分型GlcNAc、N-乙酰氨基乳糖重復(fù)序列的復(fù)雜型或雜合型聚糖及相對高通量的糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)，即凝集素親和層析、雙向電泳(2-DE)膠上熒光顯示聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)分析，初步建立了正常人肝臟組織W6A親和型糖蛋白表達(dá)譜和數(shù)據(jù)庫。同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用凝集素親和層析、2-DE、復(fù)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

3、(Multiplex Proteomics)、MALDI-TOF-MS/MS技術(shù)比較分析正常人肝組織和伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織WGA親和型糖蛋白，獲得了它們的差異表達(dá)修飾譜，發(fā)現(xiàn)VCP protein、Prohibitin、Peroxiredoxin 2等WGA親和型差異糖蛋白，驗(yàn)證了腫瘤組織中VCPprotein糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，且除了唾液酸之外還存在其他導(dǎo)致WGA親和力增強(qiáng)的糖鏈結(jié)構(gòu)。 第一部分：正常人肝組織WGA親和型糖蛋白

4、數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析。本部分研究旨在建立相對穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)，并以此為基礎(chǔ)，建立正常人肝臟組織WGA親和型糖蛋白表達(dá)譜和數(shù)據(jù)庫，為研究健康人肝組織糖基化修飾譜奠定了基礎(chǔ)，推動(dòng)了后續(xù)的肝臟疾病比較糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究。 選擇30例健康人供肝的混合樣本，優(yōu)化組織總蛋白的提取方法，以便更充分地提取組織總蛋白。通過WGA親和層析柱后，獲取WGA親和型糖蛋白，與總蛋白分別進(jìn)行聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，發(fā)

5、現(xiàn)通過親和層析使得WGA結(jié)合的糖蛋白得到富集，主要集中于47KDa左右。 第二部分肝癌相關(guān)的WlGA親和型糖蛋白比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。本部分研究在第一部分建立的糖蛋白表達(dá)全譜的技術(shù)平臺(tái)上，進(jìn)一步改進(jìn)，引入復(fù)合蛋白質(zhì)組學(xué)(MP)技術(shù)，通過凝集素親和層析和糖蛋白染色雙篩選盡量能夠排除少數(shù)凝集素非特異結(jié)合的蛋白。比較正常人肝組織與伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織WGA親和型糖蛋白的差異，篩查與肝癌相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)，旨在篩選肝癌預(yù)測、診斷標(biāo)記物

6、，為差異/比較糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)手段。從30例正常人肝組織混合樣本和30例伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織原發(fā)灶中分別提取總蛋白，層析后，進(jìn)行WGA親和和印跡、SDS-PAGE以及2-DE比較分析。 結(jié)論：1．建立了兩種結(jié)構(gòu)糖蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)平臺(tái)：1)凝集素親和層析、2-DE膠上熒光顯示聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS的高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)；2)聯(lián)合凝集素親和層析、2-DE、MP技術(shù)以及MALDI-TOF-MS/MS技術(shù)的差異

7、糖蛋白質(zhì)組學(xué)的高效率技術(shù)平臺(tái)。2．應(yīng)用凝集素親和層析、2-DE膠上熒光顯示聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析，初步建立正常人肝組織的WGA親和型糖蛋白表達(dá)譜和數(shù)據(jù)庫，WGA親和型糖蛋白主要參與體內(nèi)代謝過程，發(fā)揮催化反應(yīng)和結(jié)合反應(yīng)的作用。3．應(yīng)用聯(lián)合凝集素親和層析、2-DE、MP技術(shù)以及MALDI-TOF-MS/MS技術(shù)的差異糖蛋白質(zhì)組學(xué)的高效率技術(shù)平臺(tái)，建立了正常人肝組織與伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織WGA親和型糖蛋白差異表達(dá)譜，鑒定出24種

8、差異糖蛋白。VCP蛋白存在唾液酸化，同時(shí)也存在其他可能導(dǎo)致與WGA親和力增強(qiáng)的糖鏈結(jié)構(gòu)。 潛應(yīng)用價(jià)值：1．建立的相對穩(wěn)定的高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)有助于今后疾病相關(guān)的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究，對篩選出疾病發(fā)生、發(fā)展中相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)有重要價(jià)值。2．正常人肝組織的WGA親和型糖蛋白表達(dá)譜和數(shù)據(jù)庫的初步建立，為研究健康人肝組織糖基化修飾譜奠定基礎(chǔ)。3．篩選出24種WGA親和型差異糖蛋白，部分糖蛋白有可能成為肝癌診斷及復(fù)發(fā)預(yù)測的