Gal3ST-2和Sulfo-Lex影響人肝癌細(xì)胞黏附和增殖的分子機(jī)制研究.pdf

1、半乳糖:3-O-磺?；D(zhuǎn)移酶-2(Gal:3-O-sulfotransferase-2,Gal3ST-2)是一個(gè)新近克隆的磺?；D(zhuǎn)移酶,位于人染色體2q37.3,催化外側(cè)糖鏈末端半乳糖3位羥基的磺?；?可作用于Ⅰ型或Ⅱ型糖鏈,其生物學(xué)功能還不明確?；酋；疞ewis抗原(3'-Sulfo-βGal1,3/1,4(α1,4/1,3Fuc)GlcNac-R,sulfo-Lewis)是N-連接或O-連接糖蛋白的外側(cè)巖藻糖基化的乙酰半乳糖胺(即L

2、ewis抗原)的磺?；擎湣Ｍㄟ^(guò)Gal3ST的催化,將磺?；鶊F(tuán)從PAPS分子上轉(zhuǎn)移到外側(cè)糖鏈的半乳糖3位羥基上,最后通過(guò)巖藻糖基化而形成,參與磺?；疞ewis抗原合成的磺酰基轉(zhuǎn)移酶主要是Gal3ST-2和Gal3ST-3。以前的研究表明磺?；陌肴樘擎溑c腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān),高分泌型的大腸癌LS174T-HM7細(xì)胞株(從大腸癌細(xì)胞LS174T中篩選出的具有更高肝臟轉(zhuǎn)移潛能的突變株)合成的黏蛋白上外側(cè)糖鏈主要是3'-sulfo-Lex(sulf

3、o-3Galβ1-4(Fucα1-3)GIcNAc-R)抗原簇,它的合成需要Gal3ST-2的參與。而本實(shí)驗(yàn)室以前的研究結(jié)果也證實(shí)了Gal3ST-2可以通過(guò)影響整合素的表達(dá)來(lái)參與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。通過(guò)血液和淋巴的轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中獲得的一種能力,除此之外,腫瘤細(xì)胞相對(duì)正常細(xì)胞來(lái)說(shuō)還有對(duì)抗生長(zhǎng)抑制因子的能力、在缺乏內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)下增殖的能力、無(wú)限復(fù)制的潛能和規(guī)避凋亡的能力。Gal3ST-2和sulfo-Lex是否會(huì)對(duì)這些方

4、面產(chǎn)生一定的影響引起了我們的關(guān)注。因此,我們的研究著重探討了Gal3ST-2和sulfo-Lex對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附和增殖的影響及其相應(yīng)的分子機(jī)制。研究分為兩個(gè)部分。
　　第一部分Gal3ST-2和Sulfo-Lex參與肝癌細(xì)胞黏附的機(jī)制研究
　　由于Gal3ST-2在很多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較高,所以我們采用RNA干擾技術(shù)顯著降低Gal3ST-2的表達(dá),進(jìn)一步探討Gal3ST-2參與腫瘤進(jìn)展的可能機(jī)制。在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中轉(zhuǎn)

5、染Gal3ST-2 siRNA質(zhì)粒,48h后通過(guò)RT-PCR檢測(cè),證實(shí)細(xì)胞中Gal3ST-2的表達(dá)明顯降低,而且與陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的多邊形變?yōu)榻扑笮?與細(xì)胞培養(yǎng)器皿的黏附性下降,而且更容易被胰酶消化。為了進(jìn)一步探討Gal3ST-2對(duì)腫瘤進(jìn)展中細(xì)胞的黏附起重要的作用,我們觀察了Gal3ST-2 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與VN的黏附能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞的黏附能力明顯下降。而且在Gal3ST-2siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,

6、整合素中的αV亞基明顯下調(diào),而β3的表達(dá)無(wú)明顯改變,這與Gal3ST-2同家族的腦苷脂磺?；D(zhuǎn)移酶(CST)對(duì)整合素的調(diào)節(jié)類(lèi)似。為了研究磺?；痩ewis抗原的作用,我們?cè)诩?xì)胞中加入了外源性的Lewis-x trisaccharide和Lewis-x trisaccharide 3'-sulfatesodium salt。結(jié)果表明Lewis-X trisaccharide 3'-sulfatesodium salt促進(jìn)了細(xì)胞與VN之間的黏

7、附,增加了整合素亞單位αV的表達(dá),但Lewis-x trisaccharide處理的細(xì)胞與對(duì)照相比沒(méi)有明顯的改變。這一結(jié)果表明Lewis抗原的磺?；揎棇?duì)于細(xì)胞的黏附功能來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。而且Lewis-x trisaccharide 3'-sulfatesodium salt能夠在Gal3ST-2被干擾的SMMC-7721細(xì)胞中發(fā)揮同樣的作用,并使得細(xì)胞的形態(tài)由偏梭形趨向正常的多邊形,而加入Lewis-x trisaccharide或?qū)φ?/p>

8、細(xì)胞的形狀未有明顯的改變。這說(shuō)明sulfo-Lewis雖然不是Gal3ST-2催化的唯一產(chǎn)物,但卻是一種重要的產(chǎn)物,它可以在某種程度上彌補(bǔ)Gal3ST-2的缺乏對(duì)肝癌細(xì)胞帶來(lái)的影響。
　　第二部分Gal3ST-2與sulfo-Lex參與腫瘤存活、增殖和凋亡的機(jī)制研究
　　為進(jìn)一步探討Gal3ST-2與sulfo-Lex的調(diào)控機(jī)制,我們又觀察了Gal3ST-2與sulfo-Lex對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響。將Ga

9、l3ST-2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增值能力顯著的降低,ILK的表達(dá)明顯下降。在細(xì)胞的增殖和存活中發(fā)揮重要作用的Akt和有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶也受到了影響,表現(xiàn)為ERK和Akt的磷酸化水平降低。而受ILK調(diào)控的E一鈣粘蛋白的表達(dá)卻有所上調(diào)。E-鈣粘蛋白是一種重要的介導(dǎo)嗜同性細(xì)胞黏附的分子,能夠通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附而起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用,這與我們以前的研究結(jié)果,即Gal3ST-2可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)

10、移,是一致的。ILK的表達(dá)降低使得GSK-3β的磷酸化減少,活性增強(qiáng),所以我們檢測(cè)到GSK-3β第9位絲氨酸的磷酸化降低,下游絲,蘇氨酸磷酸化的β-連環(huán)蛋白的表達(dá)量增加。絲/蘇氨酸磷酸化的β-連環(huán)蛋白可與GSK-3β,APC,Axin形成降解復(fù)合物,導(dǎo)致胞內(nèi)游離的β一連環(huán)蛋白減少,進(jìn)入核內(nèi)的β-連環(huán)蛋白也隨之減少,導(dǎo)致下游與細(xì)胞增殖相關(guān)的癌基因c-myc以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclin D1的表達(dá)亦減少。另一方面我們用PY20檢測(cè)了β-

11、連環(huán)蛋白的酪氨酸磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化的β-連環(huán)蛋白的表達(dá)降低,但酪氨酸磷酸化對(duì)β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞信號(hào)方面所起的作用至今還沒(méi)有完全揭開(kāi)。有報(bào)道它能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)細(xì)胞增殖。Gal3ST-2被干擾除了可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖外,還可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,western blot結(jié)果顯示抗凋亡的Bcl-2蛋白的表達(dá)量下降,促凋亡的Bax的表達(dá)沒(méi)有明顯變化,所以Bcl-2/Bax的水平下調(diào),細(xì)胞的凋亡比例增加。而用外源性的Lewis-x tr