LAL和STAT3的活化對小鼠肺穩(wěn)態(tài)性影響的研究.pdf

1、第一部分 溶酶體酸性脂肪酶對小鼠肺板層小體形成及肺穩(wěn)態(tài)性影響
　　肺主要包括通氣和換氣兩大功能,氣體是通過肺泡和血液把氧氣和二氧化碳進行交換從而完成。肺泡壁表面被覆肺泡Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞。肺泡Ⅱ型細胞中的板層小體是由管狀髓磷脂構成的囊狀結構,主要成分包括脂蛋白和溶酶體酶,它是作為分泌和儲存肺泡表面活性物質(zhì)的場所。板層小體通過胞吐作用釋放表面活性物質(zhì)于肺泡內(nèi)表面,降低肺泡表面張力,維持肺泡大小,防止肺泡壁塌陷。肺泡表面活性物質(zhì)主要成

2、分為90％-95%的脂質(zhì)和5%-10%的表面活性物質(zhì)相關蛋白,80%的脂質(zhì)是磷脂,另有約10%左右的脂質(zhì)由中性脂構成。膽固醇酯(Cholesteryl ester,CE)和甘油三酯(Triglycerides,TG)是中性脂的重要組成部分。溶酶體酸性脂肪酶(Lysosomal acid lipase,LAL)是膽固醇酯和甘油三酯等中性脂在細胞內(nèi)代謝所必需的水解酶。有關表面活性物質(zhì)中表面活性物質(zhì)相關蛋白和磷脂在降低肺表面張力,維持肺的順應

3、性以及機體防御等方面作用的研究較多,但關于中性脂的作用國內(nèi)外的研究報道很少。
　　為了進一步研究中性脂代謝在肺組織中的作用,我們首次構建了強力霉素(Doxycycline,DOX)誘導調(diào)控的hLAL過表達于肺泡上皮細胞的CCSP-rtTA/(tetO)7-hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,此雙轉(zhuǎn)基因小鼠調(diào)節(jié)基因CCSP-rtTA帶有大鼠2.3kbCCSP基因啟動子調(diào)控下的rtTA融合蛋白基因,目的基因TetO-CMV-hLAL帶有7個拷貝

4、的TetO和部分CMV啟動子組成的四環(huán)素反應元件(TRE)調(diào)控下的hLAL。由于rtTA特異性表達于肺泡Ⅱ型細胞,食物中加入DOX,使目的基因hLAL轉(zhuǎn)錄激活并特異性表達于肺泡Ⅱ型細胞。
　　RT-PCR及Western Blot結果顯示,DOX處理CCSP-rtTA/(tetO)7-hLAL轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)可誘導hLAL mRNA及蛋白的表達,并且hLAL過表達加速中性脂(包括膽固醇酯和甘油三酯)的降解,降低了肺泡灌洗液中性脂

5、的濃度。為了進一步了解中性脂的減少對肺泡Ⅱ型細胞內(nèi)板層小體的影響。分別提取DOX食物處理6個月及未處理hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織作電鏡切片。結果顯示DOX處理組hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺泡Ⅱ型細胞內(nèi)板層小體數(shù)量及表面積明顯減少。未經(jīng)DOX處理組小鼠肺泡Ⅱ型細胞內(nèi)板層小體無明顯異常。
　　肺泡表面活性物質(zhì)中除了脂質(zhì)成分外,肺泡表面活性物質(zhì)相關蛋白對板層小體的形成及表面活性物質(zhì)的穩(wěn)定性也發(fā)揮一定的作用。為了了解hLAL基因過表達對肺泡表面

6、活性相關蛋白的影響,采用RT-PCR及Western Blot方法檢測DOX處理組及未處理組的hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織表面活性物質(zhì)相關蛋白A,B,C(SP-A,SP-B,SP-C)及CCSP的mRNA、蛋白的表達水平。結果證實DOX處理組hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中SP-C基因mRNA及蛋白水平明顯降低,而SP-A,SP-B及CCSP基因表達水平無明顯變化。
　　肺泡巨噬細胞參與肺泡表面活性物質(zhì)的清除及再利用,從而在維持肺穩(wěn)態(tài)中

7、發(fā)揮著一定的作用。由于肺組織內(nèi)中性脂減少,因此推測參與表面活性物質(zhì)清除及再利用的肺泡巨噬細胞可能也相應減少。于是測定了hLAL轉(zhuǎn)基因小鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞的數(shù)量。結果顯示,處理組4個月及8個月小鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞比未處理組明顯減少,肺組織中出現(xiàn)區(qū)域性肺不張及區(qū)域性肺氣腫等形態(tài)學改變。因此,認為中性脂在維持肺泡的組織結構及肺穩(wěn)態(tài)性中發(fā)揮著一定的作用。
　　小結:
　　本實驗表明:(1)hLAL基因過表達降低了肺內(nèi)膽固醇酯

8、和甘油三酯的濃度,肺泡Ⅱ型細胞內(nèi)板層小體的數(shù)目減少。(2)hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中SP-C基因mRNA及蛋白水平明顯降低,而SP-A,SP-B及CCSP基因表達水平無明顯變化。(3)DOX處理組hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺泡灌洗液中的巨噬細胞數(shù)量明顯減少,肺組織出現(xiàn)區(qū)域性肺不張及區(qū)域性肺氣腫等形態(tài)學改變。
　　結論:
　　中性脂對肺泡Ⅱ型細胞板層小體形成、維持肺泡的組織結構及肺的穩(wěn)態(tài)性發(fā)揮著一定的作用。
　　第二部分 S

9、TAT3信號途徑活化誘發(fā)肺部炎癥反應及肺癌形成
　　信號傳導和轉(zhuǎn)錄活化因子3(Signal transduction and activators of transcription family3,STAT3)作為轉(zhuǎn)錄因子在信號傳導和轉(zhuǎn)錄活化過程中發(fā)揮重要作用。IL-6家族細胞因子通過與其受體IL-6R結合激活細胞內(nèi)JAKs,JAK激酶磷酸化STAT3705位酪氨酸位點(Y705),形成同/異源二聚體,并移位至核內(nèi),啟動靶基因的轉(zhuǎn)

10、錄,從而將短暫的胞漿信號轉(zhuǎn)化為長期的基因表達。JAK-STAT信號傳導途徑具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的作用,廣泛參與調(diào)節(jié)細胞生長、免疫反應以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定相關的生命活動。但是,迄今為止始終沒有一個動物模型證實STAT3信號途徑的活化可以直接導致腫瘤的發(fā)生。
　　利用STAT3C分子能模擬STAT3形成二聚體才能核轉(zhuǎn)位的生理特性,采用Tet-on基因表達系統(tǒng),建立CCSP-rtTA?(tetO)7-CMV-STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠

11、模型,在強力霉素(Doxycycline, DOX)的調(diào)控下,STAT3于特定時間、特異的在肺泡上皮細胞表達。經(jīng)DOX食物喂養(yǎng)后,CCSP啟動子可調(diào)控目的基因STAT3C基因在肺泡Ⅱ型上皮細胞過表達。DOX處理9個月的CCSP/STAT3C小鼠肺組織內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應并導致肺腺癌的發(fā)生。采用流式細胞儀、基因芯片、Real-Time PCR及免疫組織化學的方法檢測STAT3C過表達引起的肺內(nèi)微環(huán)境的變化。發(fā)現(xiàn)STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中出

12、現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤,基因芯片篩選分析結果顯示肺癌形成時期肺組織中許多細胞因子及趨化因子表達升高,Real-Time PCR證實在DOX處理早期肺泡Ⅱ型細胞多種細胞因子、趨化因子表達增高。基因芯片分析還發(fā)現(xiàn)TTF-1、SHH等肺發(fā)育相關基因表達亦明顯增高,這些基因表達將促進肺泡上皮細胞增生。因此,認為STAT3C誘發(fā)肺癌的過程可能通過兩個階段完成,第一個階段異常表達的細胞因子/趨化因子誘發(fā)肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤,干擾免疫監(jiān)視從而促進了腫瘤發(fā)

13、生發(fā)展。第二個階段肺發(fā)育相關基因表達的再激活促進了肺上皮細胞增殖。
　　小結:
　　本實驗表明(1)CCSP-rtTA(tetO)7-CMV-STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,在DOX誘導調(diào)控下,STAT3特異性表達于肺泡Ⅱ型上皮細胞,DOX處理9個月的STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠中肺組織中大量炎癥細胞浸潤、肺腺癌的形成。(2)基因芯片篩選分析結果顯示DOX處理STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中大量細胞因子、趨化因子及肺發(fā)育相關基因(