胃癌相關(guān)基因表達(dá)與Wnt、NF-κB和Stat3信號途徑活化的相關(guān)性.pdf

1、背景與目的:胃癌是我國乃至全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)生具有多階段性，大致經(jīng)歷了由正常黏膜一癌前病變(慢性萎縮性胃炎和腸上皮化生)一胃癌(腸型、彌漫型和混合型)的演變過程。同時(shí)，胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及癌基因的表達(dá)、抑癌基因的失活以及修復(fù)基因的異常，并且與生活飲食習(xí)慣相關(guān)，其確切的發(fā)病機(jī)制還不明確。大連醫(yī)科大學(xué)遼寧省癌癥基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與澳大利亞墨爾本大學(xué)癌癥研究中心合作，利用基因芯片雜交技術(shù)，對胃癌及其相關(guān)病變的

2、基因表達(dá)譜進(jìn)行的研究，發(fā)現(xiàn)在各類胃癌中存在著一些具有共性的上調(diào)基因，即胃癌相對特異性基因。在此基礎(chǔ)上，我們對胃癌相對特異性基因按功能加以分類，篩選出一些在腫瘤發(fā)生發(fā)展的某些過程中具有代表性并起重要作用的基因，包括與細(xì)胞生存和增殖相關(guān)的c-Myc，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的cyclin D1，參與遷移與轉(zhuǎn)移的CD44和MMP-7，與新生血管形成密切相關(guān)的VEGF以及和凋亡逃逸相關(guān)的survivin，并對所選擇基因在胃癌和癌前病變組織中的表達(dá)進(jìn)行

3、檢測，分析這些基因的表達(dá)規(guī)律，探討基因表達(dá)調(diào)控及其在腫瘤治療學(xué)方面的意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展中遵循著相似的動態(tài)變化，具有明顯的趨同性。此外還發(fā)現(xiàn)這些基因的轉(zhuǎn)錄均與Wnt信號通路的活化有關(guān)，即這些胃癌相對特異性基因均為Wnt通路的靶基因。 本課題以胃癌臨床術(shù)后標(biāo)本和4個(gè)胃癌細(xì)胞系作為研究對象，胃癌組織按Lauren法分為腸型胃癌和彌漫型胃癌兩個(gè)亞型，以癌前病變組織(慢性萎縮性胃炎和腸上皮化生)為對照，檢測利用基

4、因芯片雜交技術(shù)所篩選的胃癌相對特異性基因在胃癌和癌前病變組織中的表達(dá)，利用同一個(gè)腫瘤實(shí)驗(yàn)體系檢測Wnt，NF-κB和Stat3信號途徑的活化狀態(tài)，分析探討它們與胃癌相對特異性基因表達(dá)的相關(guān)性。迄今為止，還沒有關(guān)于利用一個(gè)腫瘤實(shí)驗(yàn)體系同時(shí)檢測這三個(gè)信號通路的活化狀態(tài)及其與一系列下游基因表達(dá)相關(guān)性的研究報(bào)道。闡明這些學(xué)術(shù)問題可以為胃癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、預(yù)防乃至治療方法的選擇提供新的依據(jù)和思路，具有明顯的腫瘤生物學(xué)和預(yù)防腫瘤學(xué)意義。

5、 材料與方法:胃癌及癌旁組織均選自大連醫(yī)科大學(xué)遼寧省高校癌癥基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室建立的人胃癌冰凍組織庫。實(shí)驗(yàn)所需胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和HGC-27購于美國ATCC(American Type Cell Culture)細(xì)胞庫。MGC803(人胃低分化粘液癌)和BGC823(人胃低分化癌)從北京腫瘤研究所引進(jìn)。本研究基于石蠟組織微陣列技術(shù)，采用免疫組化、免疫熒光、RT-PCR、Western蛋白印跡分析等方法，在不同病

6、變胃組織和胃癌細(xì)胞系中檢測所篩選的胃癌相對特異性基因表達(dá)以及Wnt，NF-κB和Stat3信號途徑的活化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件包應(yīng)用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果: 一．七種癌基因在不同病變胃組織中的表達(dá)/分布1．c-Myc、cyclin D1、CD44s、CD44v6、MMP．7、VEGF和survivin在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌前病變組織(p<0

7、.05)。 2．MMP-7在腸型胃癌中的表達(dá)明顯高于彌漫型胃癌(p<0.01)，而其余基因在不同組織學(xué)類型胃癌中的表達(dá)無差異(p>0.05)。 3．cyclin D1和survivin在腸上皮化生組織中的表達(dá)明顯高于慢性萎縮性胃炎(p<0.05)，而其余基因在兩種癌前病變組織中的表達(dá)無差異(p>0.05)。 二．Wnt2、β-catenin和TCF4在不同病變胃組織中的表達(dá)1．Wnt2在胃癌組織中表達(dá)率為90-3

8、﹪(28/31)，多呈現(xiàn)為強(qiáng)染色(17例)，明顯高于癌前病變組織，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著(p<0.01)；而且Wnt2在兩種類型胃癌中表達(dá)頻率均較高，兩組間無差異(矽>0.05)。 2．β-catenin的核易位表達(dá)在癌前和胃癌兩組間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(p<0.01)。在兩種類型胃癌組織中的表達(dá)無差異(p>0.05)。 3．在全部31例胃癌組織中均可見TCF4的表達(dá)，而且均為強(qiáng)陽性染色。TCF4在癌前病變和胃癌組織間的表達(dá)統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)差異顯著(p<0.01)。 三．活化與非活化Wnt通路在不同胃組織中的分布及其與七種靶基因表達(dá)的相關(guān)性1.54例樣本中，29例存在Wnt通路活化(Wnt<'+>組)，其中27例(93.1﹪)為胃癌組織，癌前病變組織僅有2例(6.9﹪)；25例Wnt通路非活化組(Wnt<'->組)中，21例為癌前病變組織(84.0﹪)，而僅有4例(16.0﹪)為胃癌組織。在Wnt<'+>組與Wnt<'->組中癌前組織和胃癌組織的分布具有顯著統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。 2.7種靶基因在wnt<'+>組中的表達(dá)頻率均明顯高于Wnt<'->組。 四．NF-кB和Stat3在不同病變胃組織中的表達(dá)1．NF-кB在胃癌組織中表達(dá)率為74.2﹪(23/31)，明顯高于癌前病變組織(p<0.01)；NF-кB在兩種類型胃癌中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 2．Stat3在胃癌組織中的表達(dá)率為96.8﹪(30/31)，明顯高于癌前病變組織的30.4﹪(7/

11、23)(p<0.01)。Stat3在兩種類型胃癌中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 五．Wnt、NF-кB和Stat3信號途徑活化與七種靶基因表達(dá)的相關(guān)性1．在Wnt<'->組樣本中仍有部分靶基因表達(dá)，而且Wnt<'->組中NF-кB的活化與survivin和VEGF的表達(dá)密切相關(guān)(Z=2.427，p=0.027；Z=2.997，p=0.006)，而與c-Myc、cyclin D1、CD44v6尤其CD44s和MMP-7的表

12、達(dá)沒有相關(guān)性(p>0.05)。 2．在Wnt信號途徑和NF-кB都處于非活化狀態(tài)的17例樣本中，4例VEGF表達(dá)的樣本中3例(75﹪)呈現(xiàn)Stat3信號途徑的活化，而其它靶基因表達(dá)和Stat3信號通路活化的比率如下：c-Myc為66.7﹪(4/6)，survivin為50.0﹪(4/8)，MMP-7為50.0﹪ (2/4)，CD44V6為50.0﹪(1/2)，cyclin D1為44.4﹪(4/9)和CD44s為40.0﹪(2/

13、5)。六．胃癌細(xì)胞系中七種靶基因的表達(dá)與 Wnt、NF-κB和Stat3信號途徑的活化c-Myc、cyclin D1、VEGF、survivin、CD44s和CD44v6在四個(gè)胃癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，而MMP-7只在BG(2823和AGS細(xì)胞系中表達(dá)，在HGC-27中呈現(xiàn)微弱表達(dá)。Wnt途徑在MGC803和BGC823細(xì)胞系中處于活化狀態(tài)；NF-κB的活化入核出現(xiàn)在MGC803和AGS兩個(gè)細(xì)胞系中；而Stat3則在MGC803和BGC82

14、3細(xì)胞系中處于活化狀態(tài)。 Wnt、NF-κB和Stat3三條信號途徑在HGC-27細(xì)胞系中均處于非活化狀態(tài)。 結(jié)論 一．七種癌基因在癌前病變及胃癌組織中均有不同程度表達(dá)并呈現(xiàn)一個(gè)漸進(jìn)過程，提示它們在胃癌的發(fā)生發(fā)展中遵循著相似的動態(tài)變化，具有明顯的趨同性。 二．以β-catenin和TCF4的核易位作為標(biāo)志的Wnt通路活化在胃癌組織中處于主導(dǎo)地位?；罨膚nt通路多存在于胃癌組織中，而在癌前病變組織中雖然存在Wnt

15、通路某個(gè)(些)成分的表達(dá)，但β-catenin和TCF4的核易位十分少見。這說明，Wnt途徑活化在胃癌的形成和發(fā)展中起重要作用。 三．各靶基因的表達(dá)與Wnt信號通路的活化密切相關(guān)，說明Wnt通路的活化(Wnt<'+>)可能是各靶基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因素，在胃癌組織中尤其明顯。 四．NF-κB和Stat3信號傳導(dǎo)途徑在胃癌和一些胃癌相關(guān)性病變中處于活化狀態(tài)，并且在胃癌發(fā)生早期NF-κB和Stat3與Wnt途徑起協(xié)同作用，在癌