銀杏苦內(nèi)酯B對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織G-,α-q、G-,α-11及G-,α-i2 mRNA表達的影響.pdf

1、目的：血小板活化因子(PAF)是迄今發(fā)現(xiàn)最強的血小板聚集劑及血管活性脂類遞質(zhì)，在重癥急性胰腺炎(SAP)時胰腺局部損傷及全身微循環(huán)障礙的發(fā)生過程中起了舉足輕重的作用。PAF在體內(nèi)主要通過特異性的PAF受體(PAFR)將信號傳遞至細胞內(nèi)來調(diào)節(jié)細胞的生命活動。PAFR屬于七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族，活化后偶聯(lián)于特異性的異三聚體G蛋白，開啟胞內(nèi)相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 異三聚體G蛋白由α、β和γ三種不同的亞單位組成，α亞單位(Gα)是功

2、能性亞單位，決定G蛋白的活性，在G蛋白與受體及效應(yīng)器的結(jié)合中起主要作用。根據(jù)Gα氨基酸序列同源性的不同將其分為Gαs、Gαi、Gαq、Gα12四類共二十余種亞型。PAFR主要與Gαq及Gαi等G蛋白α亞單位相偶聯(lián)，產(chǎn)生第二信使將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核。另外，PAF也可以非受體依賴的將細胞外化學(xué)信號傳遞至胞內(nèi)而發(fā)揮作用。迄今為止，Gα蛋白在胰腺組織的表達情況及PAFR在胰腺組織所偶聯(lián)的Gα蛋白亞型，在國內(nèi)外相關(guān)期刊尚未見報道。 PA

3、F的特異性拮抗劑銀杏苦內(nèi)酯B(GinkgolideB，代號為BN52021)是從銀杏葉中提取的萜內(nèi)酯之一，可以競爭性的與PAFR相結(jié)合，而強烈抑制PAF的生理活性。BN52021用于實驗性SAP的治療也取得了良好的治療效果，但其具體作用機制尚不明確。本研究用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測BN52021對SAP大鼠胰腺組織Gαq、Gα11及Gαi2mRNA表達的影響，探討G蛋白在SAP時PAF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用以及BN52021

4、應(yīng)用于SAP的治療機制。 方法：1.實驗對象與分組：Wistar大鼠180只，體質(zhì)量180g～220g，隨機分為正常對照組(NC，n=60)，SAP組(SAP，n=60)及BN52021治療組(BN,n=60)，每組再分為6個時相點(1h、2h、3h、6h、12h、24h)，各組10只。 2.模型制備與標本采?。捍笫蠓Q重，標記，術(shù)前24h禁食，自由飲水。0.4％戊巴比妥鈉(40mg·kg-1)腹腔注射麻醉。仰臥位固定后，

5、備皮、消毒、鋪無菌巾，于上腹正中做2cm切口進入腹腔。找到大鼠的十二指腸和膽胰管后，用無創(chuàng)血管夾夾住膽胰管肝端，用鈍頭針頭經(jīng)十二指腸漿肌層行膽胰管逆行穿刺術(shù)。穿刺成功后，微量注射器逆行膽胰管注射5％牛磺膽酸鈉(1mL·kg-1)，推注速度0.24mL·min-1。推藥后用無創(chuàng)血管夾夾住膽胰管入十二指腸處，觀察10min，去除血管夾，確認腹腔內(nèi)無活動性出血后，兩層關(guān)腹并用無菌紗布覆蓋傷口，NC組開腹后僅翻動十二指腸并觸摸胰腺數(shù)次關(guān)腹。術(shù)后

6、BN組股靜脈注射BN52021(5mg·kg-1)，NC組、SAP組股靜脈注射等量生理鹽水。各組分別在處理后1h、2h、3h、6h、12h、24h麻醉并開腹，迅速采集心臟血液和胰腺組織。采用全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶。胰腺組織，一部分立即以冰冷的無RNA酶水沖洗后置于冰上以50～100mg分裝，隨即投入液氮速凍，-80℃超低溫冰箱妥善保存；另一部分以中性緩沖甲醛固定(40g·L-1)，石蠟包埋切片后HE染色制片，觀察胰腺組織的病理學(xué)

7、變化。 3.總RNA提取與質(zhì)量檢測：從超低溫冰箱取出胰腺組織樣本放入預(yù)冷的研釙，迅速加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)入勻漿器，加入冰冷的Trizol試劑1mL,充分勻漿。隨后在無菌操作臺內(nèi)將勻漿液轉(zhuǎn)移到一1.5mL無RNA酶離心管中。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩30sec。15～30℃放置5min，12,000rpm，2～8℃離心15min。將上清液小心轉(zhuǎn)移到另一1.5mL無RNA酶離心管內(nèi)，加入0.5mL的異丙醇，15～30℃放置10m

8、in，2～8℃，12,000rpm，離心10min。小心移去上清液，用75％酒精洗滌沉淀兩次，每次1mL，7,500rpm，2～8℃離心5min。盡可能徹底地吸走上清，無菌操作臺內(nèi)室溫空氣干燥5～10min，使酒精完全揮發(fā)。沉淀用30～50μL無RNA酶水溶解后置于-80℃超低溫冰箱妥善保存。測定樣品在260nm和280nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量，計算RNA的產(chǎn)率和污染情況。1％瓊脂糖電泳，確定RNA的完整性。 4.RT-PC

9、R：將純度高且完整性良好的總RNA樣本用隨機引物oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用PrimerPremier5.0設(shè)計Gαq、Gα11及Gαi2的特異性引物，對cDNA進行經(jīng)典PCR擴增。同時擴增管家基因β-actin，作為定量基因表達的內(nèi)部參照。擴增體系為30μL，熱循環(huán)條件如下：94℃變性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸lmin，共35個循環(huán)。每次PCR反應(yīng)都取一管以等量去離子x水取代cDNA作為陰性對照同時擴增

10、，以控制DNA污染。擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描攝片后，通過檢測光密度值對Cαq、Gα11及Gαi2mRNA的表達情況進行半定量。 結(jié)果：1.Gαq、Gα11及Gαi2在大鼠正常胰腺組織均有表達。三者在制模后不同時間均出現(xiàn)表達水平的顯著變化。 2.SAP時，Gαq的表達增高最為迅速，在制模后1h即出現(xiàn)一個表達高峰(t=-3.240，P=0.025)，隨即有所下降，到6h時表達又顯著上調(diào)(t=-3.

11、839，P=0.018)，且這種上調(diào)可被BN52021所抑制(t=-4.041，P=0.008)。 3.Gα11的表達水平在SAP發(fā)病后2h即有升高(t=-3.845，P=0.019)，3h時出現(xiàn)表達高峰(t=-4.067，P=0.005)，BN52021治療對該表達的上調(diào)沒有產(chǎn)生顯著的抑制作用，卻在制模后24h,促進了該基因的表達(t=2.722，P=0.036)。 4.制模后12hGαi2表達水平才有上調(diào)(t=-7.

12、213，P=0.000)，而且這種上調(diào)持續(xù)到24h以后(t=-8.597，P=0.000)，BN52021治療未改變這種上調(diào)趨勢。 結(jié)論：1.Gαq、Gα11及Gαi2均有可能參與了SAP的發(fā)病過程。 2.Gαq與Gα11參與了SAP時PAF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但二者所起的作用卻并不相同。Gαq是PAF信號在SAP發(fā)病過程中的主要遞質(zhì)，開啟了PAF的G蛋白信號通路。而在SAP晚期，PAF抑制了與Gαq生理功能相似的Gα11的表達

13、，同時抑制了其信號通路，在一定程度上負性調(diào)節(jié)了Gαq所起的作用。這可視為體內(nèi)的一種自我調(diào)節(jié)。 3.在SAP發(fā)病中，Gαi2與PAF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系尚不明確。一方面它在SAP發(fā)病過程中的表達上調(diào)有可能是由其它致病因素而非PAF所引發(fā)的；另一方面，可能Gαi2也參與了PAF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，但由于其在SAP時的上調(diào)發(fā)生較遲，在本課題研究的24h以內(nèi)，BN52021所起的作用尚未顯著的表現(xiàn)出來。 4.在SAP發(fā)病早期(24h以