銀杏苦內(nèi)酯B對重癥急性胰腺炎大鼠的治療作用及其作用機制.pdf

1、目的：重癥急性胰腺炎(SAP)是一種以血流動力學(xué)改變和全身炎癥反應(yīng)為特征、死亡率高的疾病。SAP的發(fā)病機制至今尚未闡明，臨床尚無有效的治療措施。細胞因子的釋放造成了全身性的反應(yīng)，如：全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MODS)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、敗血病等。此外細胞因子在作為SAP主要致死原因的多器官衰竭中起著軸心作用。關(guān)于細胞因子誘導(dǎo)SIRS的二次打擊學(xué)說則解釋了不同個體對SAP的多樣性反應(yīng)。銀杏苦內(nèi)酯

2、B(GinkgolideB，代號為BN52021)是銀杏葉提取物中重要的有效成分，對SAP具有治療作用，是炎性介質(zhì)血小板活化因子(PAF)的強拮抗劑，具有抗炎、抗血栓和抗休克形成等多種藥理作用，但其作用機制至今未明。PAF在體內(nèi)主要通過特異性的PAF受體(PAFR)將信號傳遞至細胞內(nèi)調(diào)節(jié)細胞的生命活動。PAFR屬于七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族，活化后偶聯(lián)于特異性的異三聚體G蛋白，開啟胞內(nèi)相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本實驗旨在觀察SAP大鼠血中促

3、炎因子和抗炎因子的變化以及胰腺組織Gαi2和Gαq蛋白表達量的改變，探討B(tài)N52021對SAP的治療作用及其可能的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 方法：1雄性Wistar大鼠180只隨機分為正常對照組(NC，n=60)，SAP組(SAP，n=60)及BN52021治療組(BN,n=60)，每組再分為6個時相點(1h、2h、3h、6h、12h、24h)，各組10只。 2術(shù)前24小時禁食，自由飲水。0.4％戊巴比妥鈉(40mg·kg-

4、1)腹腔注射麻醉。仰臥位固定后，備皮、消毒、鋪無菌巾，于上腹正中做2cm切口進入腹腔。找到大鼠的十二指腸和膽胰管后，用無創(chuàng)血管夾夾住膽胰管肝端，用鈍頭針頭經(jīng)十二指腸漿肌層行膽胰管逆行穿刺術(shù)。穿刺成功后，微量注射器逆行膽胰管注射5％?；悄懰徕c(1mL·kg-1)，推注速度0.20ml·min-1。推藥后用無創(chuàng)血管夾夾住膽胰管入十二指腸處，觀察10分鐘，去除血管夾，確認腹腔內(nèi)無活動性出血后，兩層關(guān)腹并用無菌紗布覆蓋傷口，NC組開腹后僅翻動十

5、二指腸并觸摸胰腺數(shù)次關(guān)腹。術(shù)后15分鐘BN組股靜脈注射BN52021(5mg·kg-1)，NC組、SAP組股靜脈注射等量生理鹽水。 3各組分別在處理后1h、2h、3h、6h、12h、24h麻醉并開胸和開腹，迅速采集心臟血液和胰腺組織。采用全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶，同時應(yīng)用ELISA技術(shù)測定1h、6h和12h血漿細胞因子水平。取一部分胰腺組織放入液氮速凍，-80℃超低溫冰箱妥善保存；另一部分以中性緩沖甲醛固定(40g·L-1

6、)，石蠟包埋切片后HE染色制片，觀察胰腺組織的病理學(xué)變化。蛋白免疫印跡法(westernblot)測定胰腺組織Gαi2和Gαq蛋白含量，用Image-ProPlusVersion4.5圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。 結(jié)果：1血漿淀粉酶結(jié)果顯示，各時相點SAP組與NC組相比較顯著升高(P＜0.05)，BN組也較NC組顯著升高(P＜0.05)，但BN組在1h,2h,3h,6h和24h較SAP組顯著降低(P＜0.05)。病理學(xué)結(jié)果顯示，S

7、AP組隨著時間的推移，胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死面積逐漸擴大，程度逐漸加重，而BN組較SAP組的組織結(jié)構(gòu)破壞相對較輕，NC組胰腺及周圍組織結(jié)構(gòu)始終大致正常。這些說明SAP動物模型制作是成功的，BN52021也有一定的治療效果。 2SAP大鼠促炎因子和抗炎因子均顯著升高。BN52021能降低血漿促炎因子含量，在SAP早期降低抗炎因子IL-10含量、提高IL-12和細胞因子拮抗劑sTNF-αR含量。血漿TNFα水平在1h時各組未

8、見明顯差異，6h時SAP組與NC組、BN組相比具有顯著性差異(P=0.001，P=0.003)，12h時SAP組與NC組、BN組相比也具有顯著性差異(P=0.020,P=0.000)。血漿PAF水平在1h時各組存在明顯差異，NC組與SAP、BN組比較，具有顯著性差異(P=0.000，P=0.000)；在6h時相點，SAP組與BN、NC組血漿PAF水平具有顯著性差異(P=0.000，P=0.000)；12h時SAP組與BN、NC組血漿PA

9、F水平具有顯著性差異(P=0.045、P=0.001)。血漿IL-10水平在1h時各組存在明顯差異，1h時SAP組與NC組和BN組相比具有顯著性差異(P=0.000,P=0.006)。血漿IL-12水平在1h時各組存在明顯差異，BN組與SAP、NC組比較，具有顯著性差異(P=0.011，P=0.000)；6h時SAP組與NC組相比具有顯著性差異(P=0.005)；12h時SAP組與NC組相比也具有顯著性差異(P=0.037)。血漿sTN

10、F-αR水平在1h時各組存在明顯差異，SAP與NC、BN組比較，具有顯著性差異(P=0.001，P=0.015)，BN與NC組比較，具有顯著性差異(P=0.000)；在6h、12h時相點，只有BN組與NC組血漿sTNF-αR水平具有顯著性差異(P=0.005，P=0.003)。在TNF-α與sTNF-αR、PAF與IL-10、PAF與IL-12、PAF與sTNF-αR之間分別存在線性相關(guān)，并分別建立相關(guān)方程。 3SAP組大鼠胰腺

11、組織Gαi2、Gαq含量與NC組相比顯著增高(P＜0.05)，BN組SAP大鼠胰腺組織Gαi2、Gαq含量顯著低于SAP組(P＜0.05)。 結(jié)論：1逆行胰膽管內(nèi)注射5％?；悄懰徕c可以成功制備大鼠SAP模型，而且BN52021對SAP有一定的治療作用。 2促炎和抗炎細胞因子與SAP的病理生理變化密切相關(guān)，SAP發(fā)生后，抗炎與促炎因子之間的平衡被打破，使得兩類細胞因子均出現(xiàn)異常表達。PAF是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性介質(zhì)，在PAF與

12、IL-10、IL-12、sTNF-αR之間存在相關(guān)性，PAF表達量的改變與三種細胞因子相關(guān)。BN52021作為PAF的拮抗劑對SAP大鼠細胞因子表達具有顯著影響，促使兩種促炎因子血漿水平降低；在SAP發(fā)病早期使抗炎因子IL-10血漿含量減少，而對IL-12血漿含量有提升作用。 3SAP發(fā)生后，胰腺組織Gαi2和Gαq蛋白含量增高，可能通過cAMP-PKA和IP3-Ca2+途徑完成細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)延續(xù)并放大。BN520