單鏈抗體介導(dǎo)的CXCR4 siRNA靶向抑制HER2+乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、背景：
　　乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤疾病，絕大多數(shù)乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。目前導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不明確，其轉(zhuǎn)移進(jìn)展期的治療仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。盡管手術(shù)，放、化療等傳統(tǒng)治療方法不斷進(jìn)步，但乳腺癌的發(fā)病率和死亡率并未大幅下降。因此，深入了解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探尋新型有效的治療策略顯得尤為迫切。
　　研究顯示，趨化性細(xì)胞因子 CXCR4與乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。拮抗CXCR4可以抑制乳腺癌的生長

2、和轉(zhuǎn)移。然而，長期應(yīng)用CXCR4拮抗劑會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。而通過siRNA抑制CXCR4表達(dá)可以阻礙腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，提示這種策略也許可以成為一種潛在的抗腫瘤治療方法。但是，如何安全有效的將siRNA遞送入細(xì)胞內(nèi)仍然是阻礙RNAi臨床應(yīng)用的巨大障礙。
　　研究表明，20％-35%的侵襲性乳腺癌患者中 HER2呈高表達(dá)，而且乳腺癌患者中HER2與CXCR4共表達(dá)率也很高。那么我們能否以HER2為靶點(diǎn)，靶向遞送CXCR4

3、 siRNA進(jìn)行體內(nèi)治療? siRNA遞送入HER2+細(xì)胞后，能否有效干涉CXCR4？CXCR4的干涉能否起到抑制乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的作用？這些問題都有待探索，本課題將就此展開研究。
　　目的：
　　獲得一種新型融合蛋白（e23sFv-9R），使其同時(shí)具有抗HER2單鏈抗體（e23sFv）靶向 HER2+腫瘤細(xì)胞的能力和具有精氨酸九聚體（9R）攜帶 siRNA的能力。使用e23sFv-9R體內(nèi)遞送CXCR4 siRNA，進(jìn)而探

4、討CXCR4的抑制對(duì)HER2+乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響，為乳腺癌的治療帶來新思路。
　　方法：
　　1.運(yùn)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建pQE30-e23sFv-9R表達(dá)質(zhì)粒；2.表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化復(fù)性后獲得e23sFv-9R，使用SDS-PAGE和Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)其鑒定；3.用凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)對(duì)e23sFv-9R siRNA結(jié)合能力進(jìn)行驗(yàn)證，并通過siRNA滴定結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析e23sFv-9R能夠結(jié)合

5、siRNA分子數(shù)；4.利用乳腺癌組織芯片進(jìn)行CXCR4染色，分析CXCR4與HER2表達(dá)之間的關(guān)系;5.使用qRT-PCR檢測常用細(xì)胞系中CXCR4與HER2表達(dá)情況；6.通過ELISA實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證e23sFv-9R的HER2抗原結(jié)合活性；7.使用共聚焦顯微鏡觀察e23sFv-9R攜帶siRNA的細(xì)胞內(nèi)化情況；8.采用 qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)分析CXCR4的體外抑制效率；9.使用CCK-8

6、實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測CXCR4干涉對(duì)HER2+腫瘤細(xì)胞的影響；10.利用熒光成像，觀測e23sFv-9R體內(nèi)分布；11.應(yīng)用 qRT-PCR，Western Blot和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn) CXCR4體內(nèi)組織中的抑制效率；12.通過 Ki-67染色和TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào) CXCR4對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；13.利用生物發(fā)光成像、腫瘤體積測量和生存分析驗(yàn)證e23sFv-9R/

7、CXCR4si對(duì)HER2+乳腺癌原位移植瘤生長和荷瘤裸鼠生存時(shí)間的影響；14.應(yīng)用生物發(fā)光成像觀測 e23sFv-9R/CXCR4si對(duì) HER2+乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響；15.使用 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析裸鼠肺內(nèi)人類管家基因hHPRT的表達(dá)；16.通過定量ELISA實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)指標(biāo)分析觀察給藥后是否會(huì)引發(fā)小鼠內(nèi)源性免疫反應(yīng)或急性應(yīng)激反應(yīng)；17.利用HE染色觀測重復(fù)給藥以及5倍治療劑量給藥對(duì)小鼠重要組織器官的影響。
　　結(jié)果：
　

8、　1.酶切鑒定和測序結(jié)果證明，pQE30-e23sFv-9R表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；2. SDS-PAGE和Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)融合蛋白e23sFv-9R表達(dá)、純化、復(fù)性成功，且蛋白大小與預(yù)期一致；3.凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)和siRNA滴定結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，e23sFv-9R可以結(jié)合siRNA，且1分子e23sFv-`9R大約可以結(jié)合3分子siRNA；4.乳腺癌組織芯片染色結(jié)果表明，CXCR4與HER2表達(dá)具有相關(guān)性；5.根據(jù)細(xì)胞qRT

9、-PCR結(jié)果結(jié)合細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)成瘤情況，選用 HER2+BT-474細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用陽性細(xì)胞，HER2-MDA-MB-231細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞；6. ELISA實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明e23sFv-9R具有HER2抗原結(jié)合活性，可以攜帶siRNA與HER2+腫瘤細(xì)胞結(jié)合；7.共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明e23sFv-9R可以遞送siRNA進(jìn)入HER2+腫瘤細(xì)胞；8. qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)e23sF

10、v-9R/CXCR4si可以有效干涉乳腺癌細(xì)胞CXCR4 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)；9. CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明干涉CXCR4可以降低HER2+腫瘤細(xì)胞的增殖及克隆形成能力，流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測結(jié)果證明干涉CXCR4可以誘導(dǎo)HER2+腫瘤細(xì)胞凋亡，Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明干涉CXCR4可以抑制HER2+腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；10.熒光成像結(jié)果表明，e23sFv-9R具有良好的在體腫瘤靶向性，且可以在腫瘤內(nèi)聚集36

11、h以上；11. qRT-PCR，Western Blot和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明e23sFv-9R/CXCR4si可以有效降低組織內(nèi)CXCR4 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)；12. Ki-67染色和TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干涉CXCR4可以抑制腫瘤組織增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；13.乳腺癌原位荷瘤裸鼠的生物發(fā)光成像、腫瘤體積測量和生存分析結(jié)果表明 e23sFv-9R/CXCR4si可以抑制HER2+移植瘤生長并提高荷瘤裸鼠生存時(shí)間；14.轉(zhuǎn)移瘤生

12、物發(fā)光成像結(jié)果表明e23sFv-9R/CXCR4si能夠抑制HER2+乳腺癌轉(zhuǎn)移；15.肺轉(zhuǎn)移瘤內(nèi)hHPRT的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果也證明 e23sFv-9R/CXCR4si能夠抑制 HER2+乳腺癌轉(zhuǎn)移；16.定量ELISA實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果證明e23sFv-9R/CXCR4si通過尾靜脈給藥不會(huì)引起小鼠出現(xiàn)內(nèi)源性免疫反應(yīng)或急性應(yīng)激反應(yīng)；17.組織器官HE染色未觀測到明顯病理變化，證明重復(fù)給藥以及5倍治療劑量給藥能夠被機(jī)體很

13、好的耐受。
　　結(jié)論：
　　1.構(gòu)建獲得了融合蛋白e23sFv-9R，其同時(shí)具有siRNA結(jié)合和HER2抗原結(jié)合能力，并可以攜帶 siRNA內(nèi)化入 HER2+乳腺癌細(xì)胞；2.體外實(shí)驗(yàn)中 e23sFv-9R/CXCR4si能夠降低 HER2+腫瘤細(xì)胞 CXCR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平，干涉 CXCR4可以降低 HER2+腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中e23sFv-9R具有良好的在體腫瘤靶向性，e23