抗前列腺癌單鏈抗體介導(dǎo)的靶向siRNA抑制Notch1基因抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前列腺癌是男性發(fā)病率第二位的惡性腫瘤,我國(guó)前列腺癌發(fā)病率也逐年升高,其發(fā)病增長(zhǎng)率已居泌尿生殖系腫瘤之首。前列腺癌具有潛伏性長(zhǎng)、發(fā)病率高的特點(diǎn)。在我國(guó)70歲以上男性人群中,高達(dá)25％的人患有前列腺癌。但臨床上前列腺癌早期診斷率低,因而多數(shù)患者失去了早期手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。
　　通過siRNA下調(diào)Notch1基因可以有效抑制人類前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而如何靶向輸送siRNA進(jìn)入特定細(xì)胞是臨床應(yīng)用此技術(shù)的主要障礙。最近有研究表明,單鏈抗體介

2、導(dǎo)的靶向輸送系統(tǒng)是高效下調(diào)相應(yīng)基因的有效方法。為了解決RNA干擾技術(shù)在體內(nèi)應(yīng)用缺乏靶向性的難題,我們擬通過抗前列腺癌單鏈抗體的融合基因,并予以優(yōu)化,進(jìn)行表達(dá)、純化后獲得融合蛋白scFv-Fdt-HA2-tp(sFH-tP),構(gòu)建成siRNA靶向輸送系統(tǒng)。利用FITC-siRNA在體內(nèi)外驗(yàn)證這一系統(tǒng)的有效性;隨后驗(yàn)證靶向輸送的針對(duì)Notch1基因抑制效果最佳的siRNA在體內(nèi)外對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。利用這一靶向輸送系統(tǒng)不但能克服s

3、iRNA在體內(nèi)輸送效率低下,還避免siRNA大量應(yīng)用時(shí)所產(chǎn)生的“脫靶”效應(yīng)、非特異性免疫反應(yīng)等問題,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的高效抑制,為RNA干擾技術(shù)在前列腺癌的臨床治療中的應(yīng)用提供理論、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前前列腺特異性膜抗原(PSMA)被認(rèn)為是一個(gè)較明確的前列腺抗原。
　　我們的前期研究工作表明Notch信號(hào)通路中的Notch1在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,應(yīng)用siRNA抑制前列腺癌細(xì)胞內(nèi)Notch1基因的表達(dá),引起細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞

4、凋亡,表明腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到有效的抑制,因此通過siRNA抑制Notch1基因有望成為一種有效的針對(duì)前列腺癌的基因治療方法。但由于缺乏有效的靶向給藥輸送系統(tǒng),常常出現(xiàn)藥物的“脫靶”現(xiàn)象,限制了此技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。本課題是在獲得高親和力的特異性抗前列腺癌單鏈抗體(scFv)的基礎(chǔ)上,擬將其與不同的基因片段融合并予以優(yōu)化,構(gòu)建成融合蛋白。使單鏈抗體介導(dǎo)的靶向輸送系統(tǒng)與特異性的siRNA結(jié)合后,在抗體的介導(dǎo)下到達(dá)靶細(xì)胞,隨抗體內(nèi)化入細(xì)胞到達(dá)靶

5、點(diǎn),從而高效抑制Notch1基因的表達(dá)。利用抗體介導(dǎo)siRNA可以特異性的到達(dá)腫瘤部位,從而實(shí)現(xiàn)特異、高效的抗腫瘤作用,同時(shí)避免siRNA大量應(yīng)用時(shí)所產(chǎn)生的“脫靶”效應(yīng),此策略將為RNAi技術(shù)在腫瘤研究、治療中的應(yīng)用開辟新途徑。
　　本研究的目的是評(píng)估單鏈抗體及兩種融合蛋白是否可以有效的將特異性siRNA輸送到PSMA陽性的前列腺癌細(xì)胞內(nèi)。融合蛋白由抗PSMA單鏈抗體(scFv)、魚精蛋白截短體(tp)構(gòu)成。將弗林蛋白酶(Furi

6、n)、流感病毒的融合肽(HA2)片段序列插入到單鏈抗體及魚精蛋白截短體之間構(gòu)成另一融合蛋白。我們的結(jié)果表明,siRNA能夠被融合蛋白特異性的輸送到PSMA陽性的前列腺癌細(xì)胞內(nèi),sFH-tP融合蛋白效果更明顯。應(yīng)用前列腺癌細(xì)胞系及前列腺癌荷瘤裸鼠模型,驗(yàn)證靶向輸送系統(tǒng)引導(dǎo)下siRNA是否能夠在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)Notch1的高效抑制,實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果。進(jìn)一步的研究證實(shí)了siNotch1融合蛋白可以在體內(nèi)及體外有效地抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。本研究成果