應(yīng)用樹枝狀高分子載體靶向基因治療前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來(lái)我國(guó)的前列腺癌發(fā)病率逐年升高。對(duì)于局部和全身轉(zhuǎn)移的進(jìn)展期患者，臨床尚無(wú)較好的治療方法。基因治療自上個(gè)世紀(jì)九十年代初用于腫瘤的治療研究以來(lái)，被認(rèn)為是治療包括前列腺癌等惡性實(shí)體腫瘤最有前途的方法。但現(xiàn)階段基因治療腫瘤的發(fā)展正受一些技術(shù)難點(diǎn)的困擾，其中缺乏在體內(nèi)安全、有效的基因載體問(wèn)題是瓶頸之一。本研究先以第5代陽(yáng)離子聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(Generation 5 Polyamidoamine Dendrimers，G5-PAMAM

2、-D)為基因載體，載含自殺基因HSV-tk和表達(dá)小發(fā)卡RNA(shRNA)的質(zhì)粒，在體內(nèi)外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療研究，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)對(duì)G5-PAMAM-D進(jìn)行修飾，獲得具有前列腺癌靶向性的載體G5-PAMAM-D-Tf，再以PAMAM-D-Tf為載體攜表達(dá) shRNA的質(zhì)粒進(jìn)行靶向前列腺癌的組織特異性RNA干擾治療研究。為前列腺癌的基因治療尋找安全、高效、并有靶向性的基因載體。 第一部分:G5-PAMAM-D 介導(dǎo)HS

3、V-tk/GOV系統(tǒng)對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)的抑制 目的：考察PAMAM-D作為自殺基因HSV-tk/GCV系統(tǒng)載體進(jìn)行前列腺自殺基因治療的可行性。 方法：以第5代PAMAM-D(G5-PAMAM-D)為載體將含增強(qiáng)型熒光蛋白(EGFP)基因片段的質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染至前列腺癌細(xì)胞系PC-3和22Rvl，成功表達(dá)EGFP后，再以 G5-PAMAM-D將含HSV-tk自殺基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-tk轉(zhuǎn)染至前列腺癌細(xì)胞系P

4、C-3和22Rvl，轉(zhuǎn)染48h后，對(duì)轉(zhuǎn)染的兩種細(xì)胞給予不同濃度的前體藥更昔洛韋(Ganciclovir,GCV)，24h后采用MTT比色法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。制作前列腺癌皮下荷瘤小鼠模型，將G5-PAMAM-D/pcDNA3-tk復(fù)合物瘤內(nèi)注射，24h后腹腔注射GCV，觀察這一復(fù)合物體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。 結(jié)果：熒光觀察及FCM結(jié)果證明G5-PAMAM-D可將pEGFP-C1轉(zhuǎn)入2種前列腺癌細(xì)胞并表達(dá)EGFP。采用G5

5、-PAMAM-D將pcDNA3-tk質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3和22Rvl細(xì)胞，給不同濃度的前體藥GCV后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組相比有明顯濃度依賴性生長(zhǎng)抑制，說(shuō)明PAMAM-D作為載體可在體外將HSV-tk自殺基因遞送至前列腺癌細(xì)胞中，并在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從而使HSV-tk/GCV 自殺基因系統(tǒng)發(fā)揮殺傷細(xì)胞的作用。荷瘤小鼠模型在給予瘤內(nèi)注射G5-PAMAM-D/pcDNA3-tk，行腹腔注射GCV治療后第40天，治療組腫瘤體積與2個(gè)對(duì)照組相比腫瘤生

6、長(zhǎng)明顯被抑制(P<0.01)，生存時(shí)間延長(zhǎng)。 結(jié)論：G5-PAMAM-D可做為前列腺腺癌自殺基因治療的基因載體，有良好的應(yīng)用前景。 第二部分:PAMAM-D介導(dǎo)STAT3-shRNA對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)的抑制作用 目的：考察G5-PAMAM-D作為小發(fā)卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒的載體，進(jìn)行前列腺癌RNA干擾基因治療的可行性。 方法：根據(jù)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和

7、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)cDNA序列結(jié)構(gòu)分別設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)EGFPmRNA、STAT3mRNA 特異的shRNA 真核表達(dá)質(zhì)粒pSilencing4,1-EGFP-shRNA和pSilencing4.1-STAT3-shRNA。在體外以G5-PAMAM-D為載體將質(zhì)粒pEGFP-C1和pSilencing4.1-EGFP-shRNA共轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞 PC-3、22Rvl，通過(guò)觀察EGFP表達(dá)反映干擾效果以及轉(zhuǎn)染效率。再以同

8、樣的方式將pSilencing4.1-STAT3-shRNA 轉(zhuǎn)入前列腺癌細(xì)胞系，MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，丫啶橙染色觀察細(xì)胞凋亡。制作前列腺癌小鼠模型，將G5-PAMAM-D與質(zhì)粒 pSilencing4.1-STAT3-shRNA的混合物注射入荷瘤鼠腫瘤內(nèi)，觀察對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)表明 G5-PAMAM-D可將pSilencing4.1- EGFP-shRNA轉(zhuǎn)入前列腺癌細(xì)胞，并明顯沉默EGFP的表

9、達(dá)，同樣可將pSilencing4.1-STAT3-shRNA有效轉(zhuǎn)入前列腺癌細(xì)胞中，明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明G5-PAMAM-D/pSilencing4.1-STAT3-shRNA 可抑制荷瘤鼠前列腺癌的生長(zhǎng)，而各對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制。 結(jié)論：G5-PAMAM-D作為基因載體，可將shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒在體內(nèi)外轉(zhuǎn)入前列腺癌組織細(xì)胞，并有效表達(dá)shRNA，G5-PAMAM-D可能成為應(yīng)用前景廣闊

10、的小干擾RNA(siRNA)的載體。 第三部分轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的G5-PAMAM-D介導(dǎo)shRNA特異性沉默列腺癌基因表達(dá)的研究 目的：本部分研究將轉(zhuǎn)鐵蛋白與G5-PAMAM-D連接，得到腫瘤選擇性載體G5-PAMAM-D-Tf，并應(yīng)用其作為shRNA 真核表達(dá)質(zhì)粒的載體，在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)染干擾實(shí)驗(yàn)，考察G5-PAMAM-D-Tf靶向性的載體進(jìn)行前列腺癌RNA干擾基因治療的可行性。 方法：先用二硫鍵法以轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tran

11、sferrin，Tf)修飾的G5-PAMAM-D，得到靶向性載體G5-PAMAM-D-T-Tf。以G5-PAMAM-D-Tf為載體將pSilencing4.1-EGFP-shRNA 和 pSilencing4.1-STAT3-shRNA 在體外轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞，用熒光觀察、RT-PCR、Western blotting及MTT法觀察對(duì)不同細(xì)胞中外源性基因EGFP和內(nèi)源性性基因STAT3的抑制作用，考察G5-PAMAM-D-Tf靶向性和有效性

12、。 結(jié)果：G5-PAMAM-D-Tf可特異性地將pSilencing4.1- EGFP-shRNA和pSilencing4.1-STAT3-shRNA轉(zhuǎn)入前列腺癌細(xì)胞，沉默其EGFP和STAT3的表達(dá)，而在正常組織細(xì)胞EGFP和STAT3的表達(dá)抑制不明顯。STAT3沉默導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制也特異性地發(fā)生在前列腺癌細(xì)胞。 結(jié)論：G5-PAMAM-D-Tf作為一種靶向性的基因載體，可以將shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒靶向性地轉(zhuǎn)入前列腺癌