siRNA靶向抑制CPB2基因?qū)θ橄侔┘毎鸗AFI表達及生長和轉(zhuǎn)移性影響的體外實驗研究.pdf

1、目的：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害患者生命健康?；颊咴诎┌Y早期即可發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移，不利于乳腺癌的有效控制和治療，因此乳腺癌的抗轉(zhuǎn)移治療成為研究的熱點。
　　 凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)是一種新發(fā)現(xiàn)的主要由肝臟分泌的具有血漿羧肽酶樣活性的單鏈糖蛋白。TAFI被凝血酶、纖溶酶及凝血酶-凝血酶調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物(T-TM)等激活形成活化TAFI(TAFIa)， TAFIa可以降解部分水解的纖維蛋白C末端的賴氨酸殘基，抑

2、制纖溶酶的活化，高濃度TAFIa還可以直接抑制纖溶酶的活性，進一步下調(diào)纖溶系統(tǒng)的活性，與臨床心、腦血管性疾病，腫瘤等許多疾病具有密切聯(lián)系。TAFI濃度受編碼基因羧肽酶B2(CPB2)控制，CPB2定位于13q14.11，TAFI mRNA翻譯合成由423個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，包括22個氨基酸組成的信號肽，92個氨基酸組成的活性肽和309個氨基酸組成的活性催化域。
　　 本研究以乳腺癌MDA-MB-231細胞系為研究對象，利用RN

3、A干擾技術(shù)，通過設(shè)計小于擾RNA（siRNA），使其靶向抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞系中CPB2基因的表達，檢測RNA干擾后乳腺癌細胞中TAFI表達水平；并探討TAFI對乳腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響；研究腫瘤與凝血、纖溶系統(tǒng)的關(guān)系；結(jié)合相關(guān)研究進一步發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的新思路。
　　 方法：
　　 1．復(fù)蘇，培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細胞系，至對數(shù)生長期傳代；
　　 2．設(shè)計并化學合成編碼TAFI基因(CPB2

4、)的3條候選特異性siRNA和1條非特異性siRNA，將細胞分為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組、陰性對照組和空白對照組5組，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細胞中；
　　 3．RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后5組MDA-MB-231細胞中TAFI mRNA的表達；
　　 4．采用Western Blot的方法檢測轉(zhuǎn)染后5組MDA-MB-231細胞中TAFI蛋白表達；
　　 5．經(jīng)過RT-PC

5、R和Western Blot實驗的結(jié)果篩選出抑制率最高的siRNA，進一步進行Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力，與陰性對照組和空白對照組進行比較；
　　 6．四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細胞存活和生長情況，與陰性對照組和空白對照組進行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1．將細胞分5組成功轉(zhuǎn)染后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)siRNA-1組，siRNA-2組，s

6、iRNA-3組與陰性對照組比較，TAFI mRNA表達水平顯著下降；
　　 2．Western Blot檢測5組細胞TAFI蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)siRNA-1組，siRNA-2組，siRNA-3組與陰性對照組比較，TAFI蛋白表達水平顯著下降，3個siRNA轉(zhuǎn)染組的抑制率分別為(55.4±4.9)％，(55.0±0.6)％，（42.6±3.5）％；
　　 3. RT-PCR和Western Blot篩選出siRNA-3為抑制

7、率最高的siRNA， Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)該組轉(zhuǎn)染后細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力較陰性對照組明顯降低；
　　 4．MTT實驗顯示TAFI表達受抑制的siRNA-3組細胞的生長受到抑制，存活率降低。
　　 結(jié)論:
　　 1．RNAi技術(shù)成功抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞系中TAFI的表達，使得乳腺癌細胞TAFI mRNA和TAFI蛋白含量明顯降低，尤其是 siRNA-3組的抑制作用最顯著，故篩選出siRNA-