幾丁寡糖結(jié)構(gòu)類似物β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的化學(xué)合成及其誘導(dǎo)植物抗病性的研究.pdf

1、本論文以氨基葡萄糖為起始原料，采用化學(xué)合成的方法，設(shè)計(jì)合成了一系列不同聚合度的幾丁寡糖結(jié)構(gòu)類似物β-1，3-乙酰氨基葡聚糖，并測(cè)定了幾丁寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物對(duì)植物抗病性的誘導(dǎo)作用，對(duì)幾丁寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)處理后煙草植株體內(nèi)抗性相關(guān)酶系活性動(dòng)態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)和分析，試圖探討上述寡糖類誘導(dǎo)物分子結(jié)構(gòu)與其誘導(dǎo)抗病性的關(guān)系。 主要的研究結(jié)果如下： 1．幾丁寡糖結(jié)構(gòu)類似物β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的化學(xué)合成 β-1，3-乙酰

2、氨基葡聚二糖的合成：以氨基葡萄糖為化學(xué)合成的起始原料，用鄰苯二甲?；Ｗo(hù)化合物7和8的2位氨基；以芐叉來(lái)保護(hù)其4，6位的羥基，避免了糖化反應(yīng)發(fā)生在4位上，從而保證了糖苷鍵的連接具有特定的立體和區(qū)域選擇性(β-1，3連接糖苷鍵)；化合物8還用硫烴基保護(hù)異頭碳上羥基，使硫糖苷作為糖基供體，成為合成乙酰氨基葡聚糖的離去基團(tuán)；化合物8的3位再用乙?；右员Ｗo(hù)，避免它同時(shí)作為糖基供體和糖基受體，只能充當(dāng)糖基供體：由3位是自由羥基、異頭碳上為甲氧基

3、的化合物7作為糖基受體，以NIS-TfOH作催化劑，7和8發(fā)生糖基化反應(yīng)，高區(qū)域、高立體選擇性、高產(chǎn)率地合成了β-1，3連接的二聚糖9，其核磁共振氫譜也證實(shí)了新產(chǎn)生的糖苷鍵為β構(gòu)型(J=8.40Hz)。 β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖和四糖的合成：將二聚糖9及隨后得到的三聚糖15脫去3'或3"位的乙?；玫降幕衔?4和20，它們?cè)僮鳛樘腔荏w，與糖基供體8在NIS-TfDH催化下進(jìn)行糖基化反應(yīng)，即可得到β-1，3連接的乙酰氨基

4、葡聚三糖15和乙酰氨基葡聚四糖21。核磁共振氫譜顯示新產(chǎn)生的糖苷鍵為β構(gòu)型(J=8.48Hz和J=8.40 Hz)。 β-1，3-乙酰氨基葡聚五糖的合成：化合物8先轉(zhuǎn)化為異頭碳為游離羥基的化合物25，然后又與三氯乙腈加成形成端基活化中間體三氯乙酰亞胺酯26。糖基供體26與3位為自由羥基，硫烴基保護(hù)異頭碳的糖基受體5發(fā)生縮合反應(yīng)，形成雙糖27；27又作為糖基供體與糖基受體20反應(yīng)生成五聚糖28。其核磁共振氫譜顯示新產(chǎn)生的糖苷鍵為β

5、構(gòu)型(J=8.54 Hz和J=8.37 Hz)。 β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的脫保護(hù)：分別嘗試了醋酸水解、催化氫化以及對(duì)甲苯磺酸(PTSA)水解的方法來(lái)脫去芐叉保護(hù)基，醋酸會(huì)使得乙酰氨基葡聚糖分解，催化氫化適用于二糖9、三糖15以及四糖21的脫保護(hù)，但五糖28在催化氫化時(shí)反應(yīng)不完全，只能使用對(duì)甲苯磺酸的水解。鄰苯二甲酰氨基的脫保護(hù)，均采用水合肼在水溶性的乙醇中回流，得到游離的氨基中間體；之后，或者直接全乙?；?，將全乙?；漠a(chǎn)物分

6、離純化后再脫去乙?；吹玫郊兌容^高的二糖和三糖的終產(chǎn)物13和19；或者游離的氨基中間體直接選擇性乙?；?，得到終產(chǎn)物24和31，再分離純化。β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的結(jié)構(gòu)確定：化學(xué)合成的4個(gè)β-(1→3)-2-脫氧-2-乙酰氨基葡聚糖，聚合度分別是從2-5，其準(zhǔn)確的化學(xué)結(jié)構(gòu)均通過(guò)高分辨質(zhì)譜以及核磁共振1H NMR．13C NMR的分析確證。上述4個(gè)化合物的總收率分別為10.56％、3.08％、1.28％和0.33％。與天然的幾丁寡糖不同

7、，合成的4個(gè)乙酰氨基葡聚糖均采取了β-1→3糖苷鍵的連接方式，是幾丁寡糖的結(jié)構(gòu)類似物，其結(jié)構(gòu)清楚、組分單一，從而提供了研究幾丁寡糖誘導(dǎo)植物抗病活性與寡糖區(qū)域異構(gòu)體之間關(guān)系的理想材料。 2．β-1,3-乙酰氨基葡聚糖誘導(dǎo)黃瓜對(duì)枯萎病的抗性研究 對(duì)5種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用：在實(shí)驗(yàn)室條件下，分別測(cè)定了3個(gè)供試寡糖即β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖和Lewisa三糖對(duì)黃瓜枯萎病菌、煙草黑脛病菌

8、、煙草赤星病菌、水稻紋枯病菌和稻瘟病菌等5種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示，3個(gè)供試寡糖對(duì)上述病原菌的菌絲生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的抑制作用。 黃瓜幼苗子葉期誘導(dǎo)對(duì)枯萎病的抗性：供試的3個(gè)寡糖，以5個(gè)不同濃度和2種誘導(dǎo)方法(葉面噴霧法和灌根法)對(duì)黃瓜幼苗分別進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，只有10μg/ml的β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖和β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖的葉面噴霧處理表現(xiàn)抗病性。而Lewisa三糖的所有誘導(dǎo)處理均不表現(xiàn)抗性。 黃瓜

9、胚根期誘導(dǎo)對(duì)枯萎病的抗性：在黃瓜胚根期，β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖和β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖浸泡處理種子胚根后，表現(xiàn)出抗病性，最低有效誘導(dǎo)濃度為5μg/ml。而LewisA三糖的5個(gè)誘導(dǎo)濃度處理均不表現(xiàn)誘導(dǎo)抗病性。3個(gè)供試寡糖在黃瓜胚根期與幼苗子葉期對(duì)枯萎病的誘導(dǎo)抗性結(jié)果相似。 3．β-1，4-乙酰氨基葡聚糖及β-1，3-乙酰氨基葡聚糖誘導(dǎo)煙草抗病性的研究 活體接種條件下寡糖誘導(dǎo)煙草對(duì)黑脛病的抗性：7個(gè)供試寡糖，以

10、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml 3種不同濃度誘導(dǎo)煙草植株，再活體莖桿接種煙草黑脛病菌后，Lewisa三糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖、β-1，4-乙酰氨基葡聚二糖處理均不表現(xiàn)抗病性；β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖、β-1，4-乙酰氨基葡聚三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖的處理對(duì)黑脛病具有誘導(dǎo)抗性。在3種不同的誘導(dǎo)濃度中，10μg/ml是大多數(shù)供試寡糖適合的處理濃度。 離體接種條件下

11、寡糖誘導(dǎo)煙草對(duì)黑脛病的抗性：7個(gè)供試寡糖以10μg/ml的濃度對(duì)煙草植株進(jìn)行誘導(dǎo)，再離體接種黑脛病菌后，β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖、L,ewisa三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚二糖均無(wú)誘導(dǎo)抗性效果；只有β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖、β-1，4-乙酰氨基葡聚三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖表現(xiàn)出誘導(dǎo)抗性。 離體接種條件下寡糖誘導(dǎo)煙草對(duì)赤星病的抗性：7個(gè)供試寡糖以10μg/ml的濃度對(duì)煙草植株進(jìn)行誘

12、導(dǎo)，再離體接種赤星病菌后，β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖、Lewisa三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚二糖均無(wú)誘導(dǎo)抗性效果；β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖、β-1，4-乙酰氨基葡聚三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖這4個(gè)供試寡糖處理則表現(xiàn)誘導(dǎo)抗性。 4．寡糖類誘導(dǎo)物的分子結(jié)構(gòu)與其誘導(dǎo)抗病性之間的關(guān)系 甲苷化Lewisa三糖的主鏈鏈接方式和糖殘基類型對(duì)誘導(dǎo)效果的影響：甲苷化Lewisa三糖對(duì)于黃瓜枯

13、萎病、煙草黑脛病和赤星病，均不具有誘導(dǎo)抗病效果，可能是因?yàn)槠渲麈湹逆溄臃绞胶吞菤埢念愋团c幾丁寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物不同，因而影響了其誘導(dǎo)活性。通過(guò)與相關(guān)資料的比較，可知Lewis寡糖類型的主鏈鏈接方式可能是決定誘導(dǎo)活性的主要因素，但不能排除糖殘基的類型對(duì)誘導(dǎo)活性的影響。 C-1位的取代基團(tuán)對(duì)誘導(dǎo)效果的影響：供試的7個(gè)寡糖均在還原端C-1含有取代的甲氧基，其誘導(dǎo)抗病效果卻表現(xiàn)出極大差異，這說(shuō)明了C-1位置上的甲氧基并非是決定這7個(gè)寡

14、糖是否具有誘導(dǎo)活性的關(guān)鍵因素。 幾丁寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物的聚合度對(duì)誘導(dǎo)效果的影響：幾丁寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)植物抗病性需要達(dá)到最低聚合度的閥值，因寡糖類型及植物病害系統(tǒng)不同而有差異。幾丁寡糖結(jié)構(gòu)類似物分別誘導(dǎo)黃瓜枯萎病，煙草赤星病和煙草黑脛病的抗性有效聚合度最低為2，3和4；幾丁寡糖誘導(dǎo)對(duì)煙草黑脛病和煙草赤星病抗性的有效聚合度最低為3。 幾丁寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物的糖苷鍵鏈接方式對(duì)誘導(dǎo)效果的影響：誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生，也許并不局限于

15、乙酰氨基葡萄糖糖殘基是否連接于C-4的位置，碳骨架主鏈?zhǔn)欠癫扇ˇ?1，4鏈接方式。β-1，4的糖苷鍵鏈接方式并非唯一的、可形成具有誘導(dǎo)活性的乙酰氨基葡聚糖的鏈接方式，碳骨架主鏈采取β-1，3鏈接方式而形成的幾丁寡糖結(jié)構(gòu)類似物——β-1，3-乙酰氨基葡聚糖同樣具有誘導(dǎo)植物的抗病活性。 幾丁寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)抗病性的特點(diǎn)：幾丁寡糖及其結(jié)構(gòu)類似物的誘導(dǎo)抗病性屬于系統(tǒng)的誘導(dǎo)抗病性，具有廣譜性(非特異性)誘導(dǎo)抗性的特點(diǎn)。 5．

16、β-1，3-乙酰氨基葡聚糖及β-1，4-乙酰氨基葡聚糖誘導(dǎo)煙草抗病性的生理機(jī)制 寡糖的誘導(dǎo)對(duì)3種防御酶活性變化的影響：5個(gè)供試寡糖誘導(dǎo)酶活性的不同效果具體表現(xiàn)在總體酶活水平、酶活峰值及到達(dá)最高峰的時(shí)間。β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖顯著提高了POD、PPO和PAl，的酶活性，誘導(dǎo)后48h達(dá)到酶活峰值，上述2寡糖對(duì)3種酶活性誘導(dǎo)效果分別為40％和99％；238％和186％；81％和73％，均高于相應(yīng)的其

17、他三種寡糖的誘導(dǎo)處理。 寡糖誘導(dǎo)的酶活性變化與煙草黑脛病誘導(dǎo)抗性效果之間的關(guān)聯(lián)性：β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖可誘導(dǎo)煙草對(duì)黑脛病的抗病性；同時(shí)也可誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)這3種酶活性的顯著性增加。表明β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖誘導(dǎo)的POD、PPO和PAL這3種酶的活性提高與誘導(dǎo)煙草對(duì)黑脛病抗病性之間在是相對(duì)應(yīng)的，具有關(guān)聯(lián)