PEG修飾對PAMAM樹狀大分子導致細胞損傷的保護作用及其機理.pdf

1、聚酰胺-胺樹狀大分子（PAMAM）是一類由中心向外對稱發(fā)散且高度分枝的納米級高分子化合物，分子內(nèi)部的空腔可以用來包裹藥物分子，而末端得基團可以通過修飾連接配體、抗體等生物活性物質(zhì)，分子所帶的高密度正電荷可以壓縮DNA。
　　 PAMAM 樹狀大分子現(xiàn)已廣泛應用于生物醫(yī)藥領域，如基因載體、藥物載體、磁共振成像對比劑等。雖然PAMAM 樹狀大分子的應用研究已取得了快速發(fā)展，但整代PAMAM 樹狀大分子表面有大量氨基基團，在生理pH條

2、件下易質(zhì)子化而帶正電，因此不可避免的具有一定的細胞毒性。利用無毒、水溶性好的免疫惰性大分子聚合物對PAMAM 進行修飾是降低毒性、提高生物相容性的有效方法之一。本實驗采用不同相對分子質(zhì)量（MW）的聚乙二醇（PEG）對五代（generation 5，G5）PAMAM進行不同程度的修飾?？疾霵AMAM的細胞毒性和PEG 修飾的保護作用及其機理，探討PEG的相對分子質(zhì)量和修飾度對保護作用的影響，并研究PEG 修飾對樹狀大分子的細胞攝取和轉(zhuǎn)染能

3、力的影響。完成的主要工作有：
　　 (1)分別用相對分子質(zhì)量為2 k和5 k的mPEG-SC對G5 PAMAM 進行兩種氨基取代度修飾，低取代度偶聯(lián)的PEG數(shù)為13、高取代度偶聯(lián)數(shù)為51，分別為G5PAMAM 表面氨基數(shù)的10%和40%。得到四種PEG-PAMAM 化合物，分別為13PEG-2k-PAMAM、51PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和51PEG-5k-PAMAM。
　　 用相對分子質(zhì)量為

4、20 k的mPEG-SC對G5 PAMAM 進行修飾，偶聯(lián)的PEG數(shù)為13，得到13PEG-20k-PAMAM。用核磁波譜和紅外光譜進行結(jié)構(gòu)表征。
　　 (2)應用噻唑藍法（MTT）考察PAMAM對鼠成纖維細胞（NIH 3T3）的細胞毒作用，結(jié)果表明PAMAM的細胞毒性有濃度和時間依賴性。比較PAMAM與PEG-PAMAM的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)PEG 修飾后樹狀大分子細胞毒性顯著降低，13PEG-2k-PAMAM、51PEG-2k-P

5、AMAM和13PEG-5k-PAMAM 分別降低12、37和34 倍，毒性最小的51PEG-5k-PAMAM可以降低105 倍。
　　 (3)用FITC標記PAMAM和PEG-PAMAM，考察細胞對樹狀大分子的攝取情況。結(jié)果表明，PAMAM可以被細胞快速攝取，PEG-2k 修飾對攝取過程沒有顯著影響，PAMAM、13PEG-2k-PAMAM和51PEG-2k-PAMAM與細胞孵育2 h后陽性細胞率接近100%。相對分子質(zhì)量較大P

6、EG 修飾的13PEG-5k-PAMAM和51PEG-5k-PAMAM的攝取率雖然略低，但也達到了80%。此外，樹狀大分子細胞攝取過程有溫度依賴性，在低溫環(huán)境條件下攝取率明顯降低，說明細胞對樹狀大分子的攝取是一個耗能過程。PAMAM和PEG-PAMAM 有核靶向力，與細胞孵育15 min后即開始在核聚集。進一步用綠色熒光蛋白（GFP）作為報告基因考察PAMAM和PEG-PAMAM的轉(zhuǎn)染能力。PAMAM和PEG-PAMAM 均能將GFP轉(zhuǎn)

7、運至NIH 3T3細胞并成功表達。調(diào)整13PEG-2k-PAMAM和51PEG-2k-PAMAM 復合物中的電荷比，可以得到與PAMAM 相似的轉(zhuǎn)染效果。
　　 (4)通過流式細胞術、熒光分光光度法考察細胞凋亡、胞內(nèi)ROS含量和線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)PAMAM誘發(fā)細胞內(nèi)ROS的增加，損傷細胞膜及線粒體膜，引起線粒體跨膜電位的降低，誘導細胞凋亡。與PAMAM 相比，PEG 修飾的樹狀大分子在較高濃度時才會引致細胞凋亡，而且凋亡率

8、明顯下降。此外，PEG 化可明顯抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和蓄積，維持線粒體膜電位穩(wěn)定，保護線粒體。說明PEG 化是通過拮抗胞內(nèi)氧化應激損傷而降低PAMAM的細胞毒性的。偶聯(lián)的PEG 鏈越多、偶聯(lián)的PEG 相對分子質(zhì)量越大，毒性下降的越明顯。
　　 (5)以人紅細胞考察PAMAM、13PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM的血液相容性。紅細胞溶血實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mg/mL PAMAM的平

9、均溶血率達到7.67±2.25%，13PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM的平均溶血率在實驗濃度范圍內(nèi)均小于5%，低于PAMAM組溶血率（P<0.05）。用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAMAM和13PEG-2k-PAMAM 能夠引起紅細胞聚集，而13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM與紅細胞作用后細胞仍維持正常形態(tài)，保持良好的懸浮性。用原子力顯微鏡（AFM）觀

10、察紅細胞表面超微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)PAMAM和13PEG-2k-PAMAM 處理后紅細胞變形，紅細胞膜被嚴重破壞，而13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM 處理的紅細胞膜表面結(jié)構(gòu)與正常紅細胞接近，膜表面粗糙度遠低于PAMAM 處理紅細胞。說明PEG的相對分子質(zhì)量會對樹狀大分子的血液相容性產(chǎn)生較大影響，相對分子質(zhì)量較大的PEG 修飾的樹狀大分子血液相容性較好。
　　 綜上所述，PAMAM細胞毒性的產(chǎn)生主要是通過誘