PRV編碼prv-miR-LLT11a靶基因鑒定及初步功能研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼內(nèi)源性小RNA分子，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平參與真核生物的基因表達調(diào)控。miRNA作為高等真核生物體內(nèi)的關(guān)鍵性因子，在抗病毒、腫瘤形成、凋亡代謝及分化發(fā)育等多種生物學進程中起到重要作用。成熟miRNA通常與mRNA(messenger RNA,mRNA)的3'非編碼區(qū)(3'untranslated(t)egion，3'UTR)結(jié)合來抑制其翻譯或降解mRNA。研究表明病毒編碼的miR

2、NA在病毒與宿主相互作用的過程中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)在感染PK-15細胞后后，其長潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（Large latency transcript,LLT）能夠轉(zhuǎn)錄出包括prv-miR-LLT11a（登錄號:M10022083）在內(nèi)11種成熟的miRNA，但是關(guān)于這些miRNA的表達時相及生物學功能研究的報道還很少見。因此，本研究選取PRV編碼的prv-miR-LLT11a

3、，對其表達時相、靶基因鑒定以及基因調(diào)控功能進行了初步研究，以期為PRV編碼miRNA的功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.莖環(huán)引物RT-qPCR檢測PRV感染PK-15細胞后prv-miR-LLT11a的表達時相
　　采用莖環(huán)引物實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR.RT-qPCR)檢測PRV感染PK-15細胞后prv-miR-LLT11a表達時相，為后續(xù)進一步研究其靶基因調(diào)控功能莫定基礎(chǔ)。采用本

4、實驗室分離保存的PRV QBA野生株感染PK-15細胞，分別在第0、1、2、4、6、8、12和24h收取細胞并提取小RNA，通過莖環(huán)引物RT-qPCR檢測prv-miR-LLT11a不同時間點相對表達量。結(jié)果表明，PRV感染PK-15細胞后11，prv-miR-LLT11a的表達量就顯著升高，2h開始顯著下降，至6h表達量降至最低，從8h開始再次顯著升高，呈現(xiàn)出極其顯著的差異性表達。結(jié)果預(yù)示，prv-miR-LLT11a在PRV感染過程

5、中可能起到基因調(diào)控的作用。
　　2.prv-miR-LLT11a靶向下調(diào)SLA-1基因的表達
　　為研究prv-miR-LLT11a的靶基因調(diào)控功能，使用在線靶基因預(yù)測工具RNAhybrid對其靶基因進行預(yù)測，結(jié)果顯示prv-miR-LLT11a能夠體外靶向豬主要組織相容性復(fù)合體一類分子基因MHCⅠ（又稱為豬白細胞抗原1，SLA-1）。為研究prv-miR-LLT11a與SLA-1的體外互作，擴增SLA-1的3'UTR，克隆

6、到雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO中，構(gòu)建真核表達載體SLA-13'UTR，同時構(gòu)建含有SLA-13'UTR突變靶位點的載體SLA-13'UTR mut，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測prv-miR-LLT11a與SLA-1的體外互作。結(jié)果顯示，prv-miR-LLT11a能夠靶向豬SLA-1基因。將prv-miR-LLT11a模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染PK-15細胞，使用RT-qPCR和Western Blot分別檢測過表達prv-m

7、iR-LLT11a對SLA-1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達影響。RT-qPCR結(jié)果顯示，prv-miR-LLT11a能顯著降低SLA-1的轉(zhuǎn)錄，在蛋白水平也有一定的抑制作用。為了進一步驗證prv-miR-L-LT11a對SLA-1基因的調(diào)控作用，采用不同劑量prv-miR-LLT11a mimics轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)prv-miR-LLT11a對SLA-1基因的抑制作用在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均沒有劑量依賴性。prv-miR-LLT11a對SLA-1的表

8、達調(diào)控是否影響機體抗原遞呈的功能還需要進一步深入研究。
　　3.prv-miR-LLT11a過表達對PLC表達及PRV增殖的影響
　　多肽裝載復(fù)合物(Peptide loading complex，PLC)是由抗原遞呈相關(guān)轉(zhuǎn)運體(Transporter associated with antigen processing，TAP)、Tapasin蛋白、鈣聯(lián)蛋白(Calnexin，CNX)、鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin，

9、CRT)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(Endoplasmic reticulum protein，ERp)、β2m等分子組成，此復(fù)合物各組分與SLA-1協(xié)同作用，結(jié)合多肽將其轉(zhuǎn)運到細胞表面，供CD8+T細胞識別，在機體發(fā)揮細胞免疫功能過程中起到重要作用。鑒于prv-miR-LLT11a對SLA-1的調(diào)控作用以及PLC與SLA-1在抗原轉(zhuǎn)運過程中的協(xié)同作用關(guān)系，本研究旨在探討prv-miR-LLT11a過表達對PLC表達以及PRV增殖的影響。采用RT-q