PRV誘導IL-10及抑制應激顆粒形成的機制研究.pdf

1、偽狂犬病毒(PRV)感染豬引起偽狂犬病，導致新生仔豬出現(xiàn)致死性腦炎，育肥豬呼吸障礙，母豬繁殖障礙等癥狀，給養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成極為不利的影響，PRV具有潛伏感染的特性，嚴重影響豬場凈化豬偽狂犬病的進程。IL-10是一種重要的多效免疫調節(jié)因子，病毒潛伏感染誘導的細胞IL-10可阻止病毒潛伏感染的細胞發(fā)生死亡，有助于儲存潛伏感染病毒的基因組。
　　應激顆粒（SGs）作為哺乳動物翻譯系統(tǒng)關閉的結果，有利于細胞應對外界環(huán)境壓力（比如熱休克，氧化

2、性應激，局部缺血或者病毒感染）。不同病毒對SGs的影響不同，有些病毒為了借助SGs募集的蛋白完成自身的復制，會誘導病毒感染細胞內形成SGs，而有些病毒為了抵抗宿主翻譯休止對自身蛋白質和基因組的復制的不利影響，則會破壞感染細胞內SGs的累積。
　　本文通過體外研究，探討PRV感染對IL-10及應激顆粒的影響，內容及結果如下:
　　1.PRV感染顯著誘導IL-10的啟動子，mRNA及分泌水平
　　通過雙熒光素酶系統(tǒng)及RT-

3、PCR方法，動態(tài)分析PRV感染PK-15細胞對IL-10啟動子及mRNA的影響，同時，在PAM細胞上，利用ELISA試劑盒檢測PRV對IL-10分泌的影響。我們發(fā)現(xiàn)PRV感染PK-15細胞6h以上，可極顯著激活IL-10的啟動子活性，且與感染時間有關，隨著感染時間的延長，激活倍數(shù)相應的增加，但是PRV誘導IL-10啟動子與感染劑量無關;而PRV感染PK-15細胞12h可誘導IL-10 mRNA水平，且與感染劑量有關;PRV感染PAM細胞

4、12h誘導其蛋白水平，18 h達到峰值，隨后逐漸降低。紫外線滅活的PRV不影響PRV誘導IL-10的啟動子，mRNA及蛋白水平，表明PRV誘導IL-10與病毒復制密切相關。
　　2.IL-10啟動子低甲基化修飾參與PRV誘導IL-10過程
　　通過BSP測序及超表達poDNMTs，分析IL-10啟動子甲基化水平與PRV誘導IL-10的關系。發(fā)現(xiàn)PRV感染PK-15細胞，可顯著減低IL-10啟動子的甲基化水平，且超表達poDN

5、MT3a或者poDNMT3b抑制PRV誘導IL-10的啟動子水平，表明IL-10啟動子的低甲基化參與PRV誘導IL-10的過程。
　　3.PRV感染不誘導SGs累積
　　通過IFA技術，動態(tài)分析PRV感染HeLa細胞誘導SGs的情況，結果顯示PRV感染不同時間均不誘導細胞內出現(xiàn)SGs，且與感染劑量無關。為了排除細胞特異性的原因，在PK-15細胞上進行同樣的實驗，得到相同的結果，即PRV感染不能誘導SGs的累積。
　　4

6、.PRV感染破壞陽性刺激物誘導SGs的累積
　　采用IFA技術，動態(tài)分析PRV感染對陽性刺激物Arsenite（依賴eIF2α磷酸化誘導SGs）及Hippuristanol（不依賴eIF2α磷酸化誘導SGs）誘導SGs的影響，結果顯示PRV感染阻礙這2種刺激物誘導SGs的累積，表明PRV阻礙SGs累積不依賴于eIF2α磷酸化。利用western-blot技術，我們發(fā)現(xiàn)PRV感染的HeLa細胞內，TIA-1蛋白水平有所下降，再用Ar