異丙酚及DMSO上調(diào)人臍靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞HO-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、臨床麻醉中常用的靜脈麻醉藥異丙酚因?yàn)槠浞咏Y(jié)構(gòu)而具有抗氧化應(yīng)激作用，大量的體外和體內(nèi)研究已經(jīng)證實(shí)了異丙酚的細(xì)胞和器官保護(hù)作用。先前的研究認(rèn)為異丙酚抗氧化應(yīng)激作用的機(jī)制包括清除H2O2，減少脂酯過氧化物的形成，減少一氧化氮合酶的形成及穩(wěn)定線粒體膜。最近的研究提出異丙酚可能是通過上調(diào)血紅素合酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)來(lái)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的。HO-1也稱為熱休克蛋白32，HO-1對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用源于其代謝產(chǎn)物的抗炎及抗氧化應(yīng)

2、激作用。然而，研究認(rèn)為在正常狀態(tài)下，僅大劑量的異丙酚能夠誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)，而臨床相關(guān)劑量的異丙酚能否影響HO-1表達(dá)變化尚不清楚。有絲分裂激酶蛋白家族(Mitogen-actived protein kinases，MAPKs)，核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)及活化狀態(tài)的核因子相關(guān)因子2(Nuclearfactor-E2 related factor2，Nrf2)參與HO-1表達(dá)上調(diào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。若臨

3、床相關(guān)劑量的異丙酚能夠誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)，那么這些信號(hào)分子很可能參與這一過程的信號(hào)傳導(dǎo)。因此，在正常及氧化應(yīng)激狀態(tài)下，臨床相關(guān)劑量的異丙酚能否上調(diào)HO-1的表達(dá)以及MAPKs，NF-κB和Nrf2是否參與異丙酚介導(dǎo)的HO-1表達(dá)上調(diào)尚不清楚，此外，若臨床相關(guān)劑量的異丙酚在正?；蜓趸瘧?yīng)激狀態(tài)下能夠誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)，那么這種表達(dá)上調(diào)是否參與或部分參與異丙酚的細(xì)胞保護(hù)作用(抗凋亡等)有待于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明。在這個(gè)背景下，本研究第一部分?jǐn)M

4、探討臨床相關(guān)劑量的異丙酚對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)HO-1mRNA和蛋白表達(dá)的作用及其細(xì)胞保護(hù)作用是否與HO-1有關(guān)，同時(shí)觀察MAPKs、NF-κB和Nrf2在這一過程中是否具有信號(hào)傳遞作用。
　　 本研究第一部分中異丙酚的溶劑二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)可與許多有機(jī)溶劑及水相溶。在臨床，DMSO具有一定的治療作

5、用，已成功用于治療肺腺癌，胃腸疾病，慢性前列腺炎，皮膚疾病，還可以作為一種區(qū)域鎮(zhèn)痛藥物。然而，DMSO治療作用的潛在分子機(jī)制尚不清楚。在進(jìn)行本研究第一部分實(shí)驗(yàn)時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)大劑量的DMSO能夠誘導(dǎo)HO-1mRNA表達(dá)上調(diào)。鑒于DMSO在臨床的應(yīng)用，我們推測(cè)DMSO的藥物治療等保護(hù)作用可能與誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)有關(guān)，因此首先通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)明確DMSO能否誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)及活性增加尤為重要。由于DMSO同樣對(duì)MAPKs具有激活或抑制作用

6、，因此，與本研究第一部分的研究設(shè)計(jì)相同，第二部分實(shí)驗(yàn)擬探討DMSO作用于HuVECs對(duì)HO-1mRNA和蛋白表達(dá)及酶活性的影響，同時(shí)研究MAPKs，NF-κB和Nrf2在其中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
　　 實(shí)驗(yàn)第一部分的結(jié)果表明在正常狀態(tài)下，臨床相關(guān)劑量的異丙酚在HUVECs不能誘導(dǎo)HO-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，而在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，異丙酚以劑量和時(shí)間依賴的方式增加了HO-1mRNA和蛋白表達(dá)水平及酶活性。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下ER

7、Ks特異性阻斷劑PD98059顯著降低了異丙酚所引起的HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)，而p38-MAPKs和JNKs阻斷劑SB203580和SP600125對(duì)異丙酚所引起的HO-1蛋白上調(diào)無(wú)顯著作用。這些數(shù)據(jù)表明，ERKs信號(hào)通路參與了異丙酚所引起的HO-1上調(diào)的信號(hào)傳導(dǎo)。進(jìn)一步研究證實(shí)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，異丙酚以劑量相關(guān)的方式增加ERKs磷酸化水平，這種作用被PD98059所阻斷。此外，異丙酚能夠顯著降低H2O2在內(nèi)皮細(xì)胞引起的細(xì)胞凋亡率。進(jìn)一步

8、而言，異丙酚的這種保護(hù)作用可部分被HO-1特異性阻斷劑ZnPPIX所阻斷，因此表明HO-1是異丙酚在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的一個(gè)重要分子機(jī)制。H2O2可增加NF-κB p65磷酸化水平及核轉(zhuǎn)移，而異丙酚單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對(duì)NF-κB p65磷酸化水平及核轉(zhuǎn)移無(wú)顯著影響，但當(dāng)異丙酚與H2O2聯(lián)合應(yīng)用時(shí)NF-κBp65磷酸化水平及核轉(zhuǎn)移水平較單獨(dú)應(yīng)用H2O2時(shí)顯著上調(diào)，說(shuō)明異丙酚在氧化應(yīng)激狀態(tài)下能夠增加NF-κBp65磷酸化水平及核轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步的研

9、究表明這一過程可被ERKs阻斷劑PD98059阻斷，提示NF-κB可能是ERKs信號(hào)通路最終導(dǎo)致HO-1表達(dá)上調(diào)的下游信號(hào)分子。
　　 實(shí)驗(yàn)第二部分的結(jié)果表明DMSO能夠在HUVECs誘導(dǎo)HO-1mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)及活性增加，當(dāng)DMSO濃度為0.1％時(shí)顯著增加HO-1蛋白表達(dá)水平。0.8％的DMSO作用于HUVECs達(dá)到1h后，HO-1的蛋白表達(dá)水平呈顯著上調(diào)。0.2％的DMSO作用于HUVECs10h對(duì)HO-1酶活性的上調(diào)

10、水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用0.8％的DMSO作用于HUVECs時(shí)間達(dá)到8h時(shí)，HO-1酶活性顯著增加。JNKs抑制劑SP600125顯著阻斷了DMSO誘導(dǎo)的HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)。然而，ERKs和JNKs抑制劑PD98059和SB203580卻對(duì)此過程無(wú)明顯作用。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)0.8％的DMSO以時(shí)間依賴的方式增加JNKs磷酸化水平，而對(duì)ERKs和p38-MAPKs的磷酸化水平卻無(wú)顯著影響。這些數(shù)據(jù)充分表明JNKs激活參與了DM

11、SO所介導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)的信號(hào)傳導(dǎo)。DMSO以時(shí)間依賴的方式增加Nrf2的核內(nèi)蓄積。在EMSA實(shí)驗(yàn)中，在無(wú)DMSO處理的內(nèi)皮細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)與Nrf2結(jié)合復(fù)合物，而在DMSO處理的細(xì)胞中，Nrf2的核轉(zhuǎn)移和DNA結(jié)合顯著增加。抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合物在DMSO處理10min鐘后開始增加并持續(xù)至60min。為進(jìn)一步證實(shí)Nrf2在DMSO上調(diào)HO-1的作用，本研究采用Nrf2siRNA干擾Nrf2的表達(dá)，結(jié)果顯示Nrf2-siRNA可將DMSO誘

12、導(dǎo)的HO-1表達(dá)減少38％。由此，充分說(shuō)明了Nrf2在DMSO上調(diào)HO-1中的作用。
　　 本研究首次報(bào)道了異丙酚和DMSO在HUVECs能夠誘導(dǎo)HO-1mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)并且初步明確這兩個(gè)過程中的潛在分子機(jī)制。鑒于內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起著重要的屏障作用，因此本研究的結(jié)果能夠?yàn)槁樽硭幃惐釉谝恍┨厥馀R床情況下應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)，如發(fā)生腦缺血再灌注損傷時(shí)。本研究第二部分發(fā)現(xiàn)DMSO為HO-1的一種新型藥理學(xué)誘導(dǎo)劑