NOD2上調(diào)人主動脈內(nèi)皮細胞Ⅰ類干擾素表達和TLR3誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的研究.pdf

1、第1章NOD2上調(diào)人主動脈內(nèi)皮細胞Ⅰ類干擾素基因的表達
　　 研究背景:胞壁二肽(MDP)是一種病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），MDP可以被胞漿核酸結(jié)合寡核苷酸域-2(NOD2)識別。NLRs是在動物體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的固有免疫分子，最先報道的通過對PAMPs刺激起反應(yīng)而發(fā)揮微生物分子識別功能的NLRs就是NOD1(CARD4)和NOD2(CARD15)，NLRs可影響動脈粥樣硬化進程。有報道稱Ⅰ類干擾素家族與人類動脈粥樣硬化斑塊的不

2、穩(wěn)定性有關(guān)。MDP能直接誘導(dǎo)細胞因子，包括干擾素的產(chǎn)生，激活并調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)MDP能誘導(dǎo)HAECs表達Ⅰ類干擾素，但其機制尚不清楚。
　　 目的:觀察MDP對HAECsⅠ類干擾素表達的影響，探討MDP通過NOD2上調(diào)HAECsⅠ類干擾素基因的表達的機制，討論MDP對HAECs其它炎癥因子表達的影響。
　　 方法:按實驗要求用MDP處理HAECs，用RT-PCR、qRT-PCR測定HAECs IFN-α，IF

3、N-β，IL-1β，IL-8和MCP-1基因的表達。用RT-PCR技術(shù)測定與MDP誘導(dǎo)HAECsⅠ類干擾素表達相關(guān)的基因NOD1，NOD2，TNF-α，IRFs表達，用Western-blot技術(shù)進一步研究其機制。
　　 結(jié)果:
　　 1.用不同濃度（0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml）的MDP處理HAECs24小時，測定IFN-α與IFN-β基因的表達，發(fā)現(xiàn)MDP呈劑量依賴的上調(diào)Ⅰ類干擾素的表達。
　　

4、 2.用10μg/ml的MDP處理HAECs不同時間(0、1、3、6、12、24h),測定IFN-α與IFN-β基因的表達，發(fā)現(xiàn)MDP呈時間依賴的上調(diào)Ⅰ類干擾素的表達。
　　 3.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時，測定NOD2基因的表達，可使NOD2基因表達上調(diào)。
　　 4.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時，測定N

5、OD1基因的表達，可使NOD1基因表達下調(diào)。
　　 5.用不同濃度(0、1、5、10、50、100ng/ml)的TNFα處理HAECs24小時，測定IFNα和IFNβ基因的表達，發(fā)現(xiàn)TNFα呈劑量依賴的上調(diào)IFNα和IFNβ基因的表達。
　　 6.用不同濃度（0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml）的MDP處理HAECs24小時，用RT-PCR測定TNFα基因的表達，發(fā)現(xiàn)基本無TNFα基因表達。
　　 7.用

6、不同濃度（0，0，2，10，0，10μg/ml）的TNFα中和抗體預(yù)處理HAECs30分鐘，再用0，10μg/ml MDP及0，5ng/ml TNFα干預(yù)24小時，用qRT-PCR測定IFNs的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNFα中和抗體不能降低MDP誘導(dǎo)的Ⅰ類干擾素表達。
　　 8.用RT-PCR檢測HAECs IRFs基因的表達，發(fā)現(xiàn)HAECs表達IRF1，2，3，9，但是基本上不表達IRF4，5，6，7，8。
　　 9.用10μ

7、g/ml MDP處理HAECs不同時間(0、5、10、30、60、120min)，發(fā)現(xiàn)MDP在5分鐘、10分鐘及30分鐘時誘導(dǎo)了IRF3的磷酸化。半定量分析結(jié)果顯示與對照組相比較磷酸化的IRF3顯著增加發(fā)生在5分鐘、10分鐘、30分鐘和60分鐘。
　　 10.用不同濃度（0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml）的MDP處理HAECs24小時，測定炎癥因子基因的表達，發(fā)現(xiàn)MDP呈劑量依賴性的上調(diào)炎癥因子包括:IL-1β，IL-

8、8和MCP-1的表達。
　　 結(jié)論:MDP可以通過IRF3途徑上調(diào)HAECsⅠ類干擾素基因的表達，MDP呈劑量依賴性的上調(diào)炎癥因子包括:IL-1β，IL-8和MCP-1的表達。
　　 第2章Poly(I-C)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡
　　 研究背景:動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，已知多種TLRs如TLR1、TLR2、TLR4、TLR9等與動脈粥樣硬化關(guān)系密切。TLR3是TLRs家族的第一個成員，其作為一種模式識別

9、受體(pathogen recognitionreceptors，PRRs)，被認為用來識別一種保守的病毒分子形態(tài)即雙鏈RNA，TLR3在多種細胞廣泛表達，但是尚未有報道認為其與動脈粥樣硬化存在相關(guān)性。TLR3可介導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡，我們發(fā)現(xiàn)TLR3還可以通過內(nèi)源性和外源性的凋亡途徑介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡從而損傷內(nèi)皮功能。
　　 目的:研究人工合成的dsRNA類似物Poly(I-C)對HUVECs生物學(xué)功能的影響，探討固有免疫系統(tǒng)

10、中PRRs在Poly(I-C)誘導(dǎo)的HUVECs凋亡過程中的作用及其機制。
　　 方法:按要求用poly(I-C)處理原代的或者永生化HUVECs，用流式細胞儀分析HUVECs的凋亡情況，用RT-PCR、qRT-PCR及流式細胞技術(shù)檢測TLR3及一些炎癥因子的表達。進一步用Westem blot、ELISA、RT-PCR、RNA干擾等技術(shù)觀察poly(I-C)對內(nèi)源性及外源性凋亡途徑中相關(guān)細胞因子的表達的影響。
　　 結(jié)

11、果:
　　 1.流式細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)用poly(I-C)干預(yù)HUVECs24小時，可見早期凋亡、晚期凋亡逐漸增多，TLR3中和抗體和siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)能顯著抑制poly(I-C)誘導(dǎo)的細胞凋亡，p63下調(diào)抑制poly(I-C)誘導(dǎo)的HUVECs細胞凋亡。
　　 2.RT-PCR還顯示HUVECs表達低水平的TRAIL，DR4和DR5，poly(I-C)呈劑量依賴方式上調(diào)TRAIL及其受體（DR4和DR5）的表達，呈劑量依賴的下調(diào)

12、Bcl-2基因的表達，上調(diào)BH3基因表達，上調(diào)TAp63α基因表達，p63RNA干擾抑制HUVECs TRAIL，DR4，和DR5的表達。
　　 3.West-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)poly(I-C)上調(diào)HUVECs TLR3蛋白的表達，在5-10μg/ml poly(I-C)干預(yù)的細胞時其TLR3蛋白表達水平較低，poly(I-C)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，上調(diào)BH3蛋白表達，上調(diào)TAp63α的表達，TLR3 shRNA下調(diào)TLR3

13、并抑制HUVECsTAp63α的表達，顯著抑制Bcl-2的下調(diào)和Noxa的上調(diào)，P63 RNA干擾下調(diào)HUVECs Bcl-2的表達，上調(diào)Noxa的表達，抑制HUVECs caspases8、9和PARP的激活。
　　 4.實時定量RT-PCR數(shù)據(jù)顯示:poly(I-C)能顯著上調(diào)HUVECs的TLR3基因表達。
　　 5.ELISA結(jié)果顯示poly(I-C)顯著上調(diào)HUVECs TRAIL表達。
　　 結(jié)論:p