PPARδ激動劑GW501516抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMP-2和細(xì)胞凋亡.pdf

1、研究背景:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一類依賴鋅離子和鈣離子的內(nèi)切酶家族成員,能特異性地與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matric,ECM)成分結(jié)合并降解細(xì)胞外基質(zhì)。大量研究發(fā)現(xiàn),MMPs在動脈粥樣硬化病變的發(fā)展過程中發(fā)揮作用,如促進(jìn)血管的新生、平滑肌細(xì)胞的遷移及表型改變、血管重塑、維持斑塊穩(wěn)定性等。MMP-2即Ⅳ型膠原酶,是MMPs家族的成員,能夠降解Ⅳ型膠原和部分變性的Ⅰ、

2、Ⅱ、Ⅲ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì),MMP-2的含量和活性與動脈粥樣硬化斑塊的形成和斑塊的穩(wěn)定密切相關(guān)。
　　PPARδ(peroxisome Proliferator-activated receptorδ)是過氧化物酶體增殖物激活型受體家族中的一員,廣泛表達(dá)于多種器官和組織,主要控制脂肪組織和肌肉中脂肪酸氧化和能量解偶聯(lián),抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥,改善動脈粥樣硬化,并參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。PPARδ的配體分為天然配體和合成配體。G

3、W501516是PPARδ的合成配體,屬于苯氧乙酸衍生物,PPARδ與 GW501516結(jié)合后,活化的PPARδ與9-順視黃酸類受體(9-cis retinoid X receptor,RXR)形成異二聚體,然后識別并于靶基因啟動子上游的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(peroxisome proliferator response element, PPRE)結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因下游的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及生物學(xué)效應(yīng)。本課題擬從細(xì)胞水平探討PPAR

4、δ對oxLDL和高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)及對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。
　　第一部分 PPARδ特異性激動劑GW501516對oxLDL、高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響
　　目的:觀察 PPARδ激動劑 GW501516對 oxLDL、高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)和對細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖的影響。
　　方法:1.用不同濃度(0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L

5、)的oxLDL與HUVEC共孵育24小時;用不同濃度(0 mM、15 mM、30mM、45mM)的高糖與HUVEC共孵育24小時;用熒光定量PCR(Rea1-time PCR)檢測細(xì)胞MMP-2 mRNA的表達(dá)。
　　2.不同濃度GW501516(0nM、1nM、10nM、100nM、1μM)預(yù)處理HUVEC1h,分別與50mg/L oxLDL或30mM高糖共孵育24h,空白組作為對照,用Western blotting和Rea1

6、-time PCR分別檢測細(xì)胞 MMP-2蛋白和mRNA的表達(dá);用不同濃度GW501516(0nM、10nM、100nM、1μM)預(yù)處理HUVEC1h,分別與100 mg/L oxLDL或30mM高糖共孵育24h,空白組作為對照,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)果:不同濃度oxLDL可誘導(dǎo)HUVEC MMP-2 mRNA的表達(dá)上調(diào),濃度為50mg/L時MMP-2 mRNA的表達(dá)達(dá)峰值,不同濃度高糖

7、可誘導(dǎo)HUVEC MMP-2 mRNA的表達(dá)上調(diào),濃度為30mM時,MMP-2 mRNA的表達(dá)達(dá)峰值。不同濃度GW501516與oxLDL共孵育HUVEC24h,HUVEC MMP-2蛋白和mRNA水平表達(dá)均下調(diào),呈劑量依賴性(P<0.05),不同濃度GW501516與高糖共孵育HUVEC24h,HUVEC MMP-2蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào),呈劑量依賴性(P<0.05)。不同濃度 GW501516分別與oxLDL、高糖共孵育HUVEC2

8、4h,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率,oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率是21.3％,不同濃度GW501516處理組凋亡率分別為17.47%、9.72%、3.94%,高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率為22.65%,不同濃度GW501516處理組凋亡率分別為20.23%,17.01%,9.38%,結(jié)果顯示GW501516可抑制oxLDL、高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。MTT法檢測不同濃度GW501516可抑制oxLDL、高糖對細(xì)胞增殖的影響。
　　第二部分干擾RNA

9、片段對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ及MMP-2表達(dá)的影響
　　目的:研究干擾RNA片段對HUVEC PPARδ基因表達(dá)的影響,了解PPARδ基因表達(dá)量發(fā)生變化時,GW501516抑制oxLDL、高糖誘導(dǎo)的MMP-2作用是否發(fā)生變化,以探討GW501516是否通過激活PPARδ通路參與調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2的表達(dá)。
　　方法:設(shè)計siRNA四條引物( NC591621972),采用siRNA干預(yù)體外培養(yǎng)的人正常臍靜脈內(nèi)皮

10、細(xì)胞,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24h后,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,用100 nM GW501516預(yù)處理轉(zhuǎn)染后的HUVEC1h,然后分別與oxLDL50mg/L和高糖30mM共孵育24h,采用Real-time PCR及Western blotting法檢測PPARδ和MMP-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果:針對PPARδ基因設(shè)計的siRNA三條引物(591621972)可沉默PPARδ的表達(dá),其中621引物作用顯著,轉(zhuǎn)染后的HUVEC

11、經(jīng)GW501516預(yù)處理和oxLDL、高糖誘導(dǎo)后,MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)量均增多,結(jié)果表明,沉默PPARδ阻抑了GW501516對oxLDL、高糖誘導(dǎo)HUVEC MMP-2表達(dá)的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1. PPARδ特異性激動劑GW501516抑制oxLDL和高糖誘導(dǎo)的HUVEC MMP-2的表達(dá);
　　2. PPARδ特異性激動劑GW501516阻抑oxLDL和高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及對細(xì)胞增殖的影響;