PPARγ激動(dòng)劑與COX-2抑制劑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:骨肉瘤(osteosarcoma)是骨組織最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,典型的惡性骨肉瘤主要發(fā)病于青少年時(shí)期,已具有顯著的局部侵襲性和早期遷移能力。但通常由于轉(zhuǎn)移病灶不易被診斷出而引起該類病患的高死亡率。目前骨肉瘤的主要治療手段為手術(shù)輔助化療。雖然病人的生存率已得到了顯著的提高,但對(duì)于伴有轉(zhuǎn)移的骨肉瘤目前仍無有效的治療手段；化療耐藥和化療后繼發(fā)腫瘤也是骨肉瘤治療過程中面臨的難題。研究表明,過氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisom

2、e proliferators activated receptor,PPAR)γ和環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用,PPARγ配體和COX-2抑制劑可使一些腫瘤細(xì)胞增殖抑制和凋亡,但PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮和COX-2特異性抑制劑NS-398對(duì)人骨肉瘤的防治作用機(jī)制尚不十分清楚。因此,本課題擬通過檢測(cè)PPARγ在人成骨肉瘤及骨軟骨瘤組織中的表達(dá),及探討PPARγ激動(dòng)劑

3、羅格列酮和COX-2特異性抑制劑NS-398對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖和凋亡的影響,以期明確羅格列酮及NS-398兩種非細(xì)胞毒性藥物有無防治骨肉瘤作用及二者是否具有協(xié)同作用,為臨床骨肉瘤的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院及河南省鄭州市骨科醫(yī)院2005年-2009年住院患者手術(shù)切除的骨肉瘤和骨軟骨瘤組織標(biāo)本,其中骨肉瘤36例,骨軟骨瘤30例。采用免疫組織化學(xué)二步法檢測(cè)全部組織中PPAR

4、γ的蛋白表達(dá)情況；
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選擇人骨肉瘤MG-63細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分:不同濃度羅格列酮干預(yù)組、不同濃度NS-398干預(yù)組、羅格列酮與NS-398聯(lián)合干預(yù)組；
　　 3.用MTT比色法分別檢測(cè)三組藥物干預(yù)不同時(shí)間(24h、48h、72h)后對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響,測(cè)定吸光度(OD)值:
　　 4.流式細(xì)胞儀分析PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮和COX-2特異性抑制劑NS-398單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)對(duì)骨肉瘤MG-6

5、3細(xì)胞前后周期分布情況的影響；
　　 5.TUNEL檢測(cè)PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮和COX-2特異性抑制劑NS-398單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞前后的細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化結(jié)果顯示:PPARγ在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中均有表達(dá),主要定位于細(xì)胞核,胞漿也有少量表達(dá),呈棕黃色顆粒。骨肉瘤組織中PPARγ的陽性表達(dá)率顯著高于骨軟骨瘤組織(P<0.01)；
　　 2.MTT結(jié)果顯示

6、:在一定濃度范圍內(nèi),羅格列酮、NS-398以及聯(lián)合用藥組干預(yù)骨肉瘤MG-63細(xì)胞不同時(shí)間后均能明顯抑制細(xì)胞增殖。隨著時(shí)間的延長,抑制作用明顯升高,但48h與72h兩組無明顯差異。分別用羅格列酮、NS-398及二者聯(lián)合干預(yù)細(xì)胞48h后,濃度為0.5μmol/L、5μmol/L、50μmol/L的羅格列酮對(duì)MG-63細(xì)胞的抑制率分別為46.7％、38.6％及18.9％,與對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液)比較,差異有顯著性(P<0.05或P<0.01

7、)；濃度為1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L的NS-398對(duì)MG-63細(xì)胞的抑制率為23.3％、41.6％及54.8％,與對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液)比較,差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；選擇二者單獨(dú)干預(yù)時(shí)藥物的最佳濃度,即:0.6μmol/L羅格列酮和100μmol/L NS-398聯(lián)合作用對(duì)MG-63細(xì)胞的抑制率可達(dá)68.8％,明顯高于單獨(dú)應(yīng)用相同濃度的羅格列酮組或NS-398組。
　　 3.流式細(xì)

8、胞術(shù)結(jié)果分析:流式細(xì)胞儀檢測(cè)MG-63細(xì)胞周期分布顯示,0.5μmol/L、5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L羅格列酮分別處理MG-63細(xì)胞24h、48h后,在0.5μmol/L～50μmol/L濃度范圍內(nèi),隨藥物濃度的增加,與對(duì)照組相比,GWG1期細(xì)胞比例明顯增多,S期和G2/M期細(xì)胞比例則明顯減少,即羅格列酮可阻滯MG-63細(xì)胞周期于G1期,且48h的抑制效果明顯強(qiáng)于24h,該作用與劑量呈負(fù)相關(guān)、與時(shí)間呈正相關(guān)；但

9、從結(jié)果亦可看出,在羅格列酮濃度為100μmol/L時(shí)其抑制作用又明顯增強(qiáng)。1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L濃度的NS-398分別處理MG-63細(xì)胞24h、48h后,在1μmol/L～100μmol/L濃度范圍內(nèi),隨著藥物濃度的增加,與對(duì)照組相比,G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加,S期和G2/M期細(xì)胞比例則逐漸減少,即NS-398可阻滯MG-63細(xì)胞進(jìn)程于G1期,該作用呈劑量、時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系；結(jié)果也

10、顯示,當(dāng)NS-398濃度達(dá)到200μmol/L時(shí),其抑制作用有所降低。分別選擇單獨(dú)使用羅格列酮或NS-398作用效果較佳的濃度聯(lián)合干預(yù)細(xì)胞,結(jié)果顯示:羅格列酮0.5μmol/L和NS-398100μmol/L聯(lián)合干預(yù)組,以及羅格列酮5μmol/L和NS-39810μmol/L聯(lián)合干預(yù)組,均可將MG-63細(xì)胞周期阻滯于G1期,且與對(duì)照組相比,G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多,其G0/G1期細(xì)胞比例分別為88.2％和94.7％,此比例也明顯高于

11、二者單獨(dú)干預(yù)組,S期和G2/M期細(xì)胞比例則相應(yīng)減少。
　　 4.TUNEL結(jié)果分析:0.5μmol/L羅格列酮或100μmol/L NS-398單獨(dú)以及二者聯(lián)合干預(yù)MG-63細(xì)胞48h后,正常對(duì)照組細(xì)胞增殖旺盛,偶見凋亡細(xì)胞。羅格列酮組和NS-398組以及聯(lián)合用藥組中均可見到散落分布的棕黃色濃著色細(xì)胞,并可見細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)邊聚、凝集成塊及散在的凋亡小體。與對(duì)照組相比,羅格列酮組和NS-398組以及二者濃度聯(lián)合用藥組的凋亡率均

12、有所升高。細(xì)胞凋亡率分別為14.3％、18.6％、21.7％,與對(duì)照組2.82％相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)亦可看出,聯(lián)合作用效果明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用兩種藥物的其中一種。
　　 結(jié)論：
　　 1.人骨肉瘤組織中PPARγ呈高表達(dá),PPARγ可能成為骨肉瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
　　 2.羅格列酮或NS-398或二者聯(lián)合作用可抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,為腫瘤的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。<