RNA干擾沉默細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-1的表達(dá)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的: 證實人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是否有細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-1（SOCS1）表達(dá)；證實RNA干擾是否能有效抑制SOCS1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)；探討沉默SOCS1的表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響。 方法: 1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC），利用RT-PCR檢測SOCS1在HUVEC中的表達(dá)。 2.設(shè)計并化學(xué)合成4對靶向SOCS1的

2、siRNA：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。 3.將帶有熒光標(biāo)記的陰性對照siRNA配制成25、50、75、100 nmol/L的4組，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，并在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，得出有最佳轉(zhuǎn)染效率的濃度。 4.HUVEC根據(jù)不同的處理因素分成8組：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和陽性對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑組、空白對照組4個對照組。將均為

3、有最佳轉(zhuǎn)染效率濃度的各組siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時后提取RNA進(jìn)行RT-PCR。篩選出1對對SOCS1沉默效率最高的siRNA。 5.將篩選出來的最有效siRNA和陰性對照siRNA以有最佳轉(zhuǎn)染效率的濃度轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后分為4組：①陰性對照siRNA；②陰性對照siRNA+缺氧20小時/復(fù)氧4小時；③SOCS1 siRNA；④SOCS1 siRNA+缺氧20小時/復(fù)氧4小時。Western Blot檢測細(xì)胞Casp

4、ase-3、Bax蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1.未經(jīng)任何干擾因素培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能高表達(dá)SOCS1。 2.siRNA在50nmol/L時有較高的轉(zhuǎn)染效率。 3.4對siRNA干擾后，SOCS1 mRNA的表達(dá)水平與陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑組和空白對照組相比明顯下調(diào)（P<0.05），與陽性對照組相比顯著下調(diào)（P<0.01），其中siRNA-3的沉默效率最高（P<0.05），陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑組和空白對照組與

5、陽性對照組相比明顯下調(diào)（P<0.05），陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑組和空白對照組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 4.對HUVEC進(jìn)行RNA干擾和缺氧復(fù)氧處理后，SOCS1 siRNA+缺氧復(fù)氧組的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平與陰性對照siRNA組、陰性對照siRNA+缺氧復(fù)氧組和SOCS1 siRNA組相比明顯升高（P<0.05），陰性對照siRNA+缺氧復(fù)氧組的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平與陰性對照siR

6、NA組相比明顯升高（P<0.05），陰性對照siRNA+缺氧復(fù)氧組的Caspase-3蛋白表達(dá)水平與SOCS1 siRNA組相比明顯升高（P<0.05），而陰性對照siRNA組與SOCS1 siRNA組之間的Caspase-3蛋白表達(dá)水平差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），SOCS1 siRNA組的Bax蛋白表達(dá)水平與陰性對照siRNA組相比明顯升高（P<0.05）。 結(jié)論: 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)未經(jīng)任何干擾因素培養(yǎng)的人臍靜