大黃魚抗病功能基因的克隆與分析.pdf

1、對(duì)大黃魚腹腔注射副溶血弧菌(實(shí)驗(yàn)組)或0.9％氯化鈉溶液(對(duì)照組)，在注射4h、1d、2d、4d、8d、12d和16d后尾部取血，測(cè)定其血清中一氧化氮合酶、溶菌酶和酪氨酸酶活力的變化情況。結(jié)果表明，注射副溶血弧菌后大黃魚血清中溶菌酶活力在2d和12d顯著高于對(duì)照組，在16d則顯著低于對(duì)照組；酪氨酸酶活力在4d和16d顯著高于對(duì)照組，在8d極顯著高于對(duì)照組；但大黃魚體內(nèi)的一氧化氮合酶活力沒有明顯增加。表明大黃魚血清中的溶菌酶和酪氨酸酶參與

2、了機(jī)體對(duì)副溶血弧菌的免疫防御。 本研究在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR技術(shù)克隆了大黃魚TNFα、Mx、IgL和IgH基因，并采用定量PCR技術(shù)分析了這四個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果如下：(1)TNFα cDNA序列全長1339 bp，5’UTR為68 bp，ORF為759 bp，3’UTR為512 bp，可編碼252個(gè)氨基酸，分子量大約為28kDa。由該序列推導(dǎo)的多肽含有跨膜域及TNF家族的標(biāo)簽序列。同源性分析表明該序列與其它硬骨

3、魚類甚至哺乳動(dòng)物的TNFα具有很高的相似性。進(jìn)化分析顯示，大黃魚TNFα與其它硬骨魚類TNFα占據(jù)進(jìn)化上獨(dú)立的分支，而哺乳類TNFα則形成另一分支。定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，在頭腎中2d和4d的弧菌組大黃魚TNFα基因表達(dá)極顯著地高于對(duì)照組；在血液中2d的弧菌組大黃魚TNFα基因表達(dá)顯著地高于對(duì)照組，而4d的弧菌組大黃魚TNFα基因表達(dá)極顯著地高于對(duì)照組。(2)獲得的2209bp Mx 全長cDNA含有一個(gè)1890bp ORF，可編碼629個(gè)

4、氨基酸，分子量大約為72kDa。在可編碼序列中，具有Mx蛋白的特征結(jié)構(gòu)，如GTP 酶基序、GTP 酶動(dòng)態(tài)蛋白超家族標(biāo)簽序列(LPRGSGIVTR)和C-端區(qū)域的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)等。對(duì)大黃魚腹腔注射副溶血弧菌后2d，其頭腎和血液中的Mx基因表達(dá)均顯著上調(diào)，且在2d均達(dá)到峰值。(3)克隆到一個(gè)977bp IgL cDNA全長序列和一個(gè)1621bp的IgH cDNA片段。IgL編碼區(qū)由可變區(qū)和恒定區(qū)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成；其互補(bǔ)決定區(qū)變化較大，與其它魚

5、類相似性較低。進(jìn)化分析顯示，大黃魚與其它魚類IgL獨(dú)立類聚成一支。定量PCR顯示，注射副溶血弧菌后8d和12d，大黃魚頭腎中的IgL和IgH基因表達(dá)均顯著地高于對(duì)照組。 引物退火控制技術(shù)(ACP)是一種在DDRT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行克隆的新方法。退火控制引物3’端的核心部分和5’端的通用引物序列部分由中間的多聚脫氧次黃苷[Poly(dI)]調(diào)節(jié)部分連接，可以顯著提高引物退火的特異性。該方法具有重復(fù)性高、假陽