利用PCR和環(huán)介導等溫核酸擴增技術(LAMP)從野生褐家鼠和屋頂鼠中檢測路氏錐蟲(Trypanosoma lewisi).pdf

1、路氏錐蟲(Trypanosoma lewisi)是一種血液鞭毛蟲，主要的中間宿主是褐家鼠(Rattus norvegicus)和屋頂鼠(Rattusrattus)，通過跳蚤傳播，呈全球性分布。長期以來，人們普遍認為路氏錐蟲是一種宿主特異性極強的非致病性原蟲。但是，這一觀念目前正在受到挑戰(zhàn)，因為人感染路氏錐蟲的病例被陸續(xù)報道，且病人有明顯的臨床癥狀。路氏錐蟲作為一種新的人獸共患病原體已引起世界衛(wèi)生組織(World Health Organ

2、ization)的重視。
　　 目前檢測路氏錐蟲的方法主要是病原學檢查，取血液涂片觀察到蟲體即可確診。病原學檢測準確率高，為診斷的金標準，但該法不便于大規(guī)模篩查，且靈敏度較低。因此，發(fā)展一種新的檢測路氏錐蟲的方法顯得尤為重要。環(huán)介導等溫核酸擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)有簡單、快速高效、高特異性、高靈敏性和成本低等優(yōu)點，適合流行病學的大規(guī)模篩查。
　　

3、本論文率先建立了檢測路氏錐蟲的LAMP體系，明確了檢測路氏錐蟲的最佳反應溫度為62℃，最佳反應時間是60min。對LAMP檢測路氏錐蟲的特異性和靈敏性進行了詳細的研究，結果表明采用的引物對路氏錐蟲有甚高的特異性，LAMP能檢測到的DNA極限水平為10fg，普通PCR能檢測到的DNA極限水平為100fg，LAMP檢測路氏錐蟲的靈敏度比普通PCR高10倍。此外，本研究結果證實，用FTA濾紙保存的血樣無需作DNA純化處理便可直接用于LAMP反

4、應，結果與預處理的沒有明顯差異，但是未經(jīng)處理的FTA濾紙保存的血樣不能直接用于普通PCR反應。這表明LAMP反應對大分子有機物的耐受性要比普通PCR強。
　　 本論文用三種方法檢測了238只野生大鼠血樣，結果表明：病原學檢測(顯微鏡)陽性率為6.7％(16/238)，PCR檢測陽性率為12.6％(30/238)，LAMP檢測陽性率為18.9％(45/238)，且病原學檢測陽性樣本在PCR和LAMP中均檢測出陽性，PCR檢測的陽性

5、樣本在LAMP中均檢測出陽性。PCR檢測的陽性率高于病原學檢測，而LAMP檢測的陽性率高于PCR檢測。對比這三種方法，本文發(fā)現(xiàn)，LAMP檢測路氏錐蟲有更高的靈敏性，更適合用于路氏錐蟲大樣品量的流行病學研究。
　　 本文利用FTA濾紙采集血液樣本，結合LAMP技術檢測路氏錐蟲，建立了從樣本采集、運輸、貯存和檢測于一體的一套完整LAMP檢測體系。基于利用LAMP檢測路氏錐蟲的研究，本文的結果表明LAMP是一種快速、簡便、成本低、高靈