皮膚成纖維細(xì)胞修復(fù)原位凍融前交叉韌帶的可行性相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前交叉韌帶（Anterior Cruciate Ligament,ACL）是膝關(guān)節(jié)內(nèi)重要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，對于維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定具有極其重要的作用，一方面其本身對防止脛骨前移起主要作用，并有部分纖維參與防止脛骨過度后移和內(nèi)外旋轉(zhuǎn)。另外一個方面，前交叉韌帶通過與后交叉韌帶和膝關(guān)節(jié)周圍軟組織的協(xié)同作用來維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定。ACL損傷的發(fā)病率隨著現(xiàn)代競技體育及全民健身運(yùn)動的發(fā)展而不斷上升，損傷后由于缺乏自我愈合能力，而會進(jìn)一步引起膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)并繼發(fā)關(guān)節(jié)炎等，

2、目前在臨床主要需用移植物在關(guān)節(jié)鏡下移植重建前交叉韌帶。各種移植物都有其局限性，組織工程技術(shù)為目前的各種器官移植技術(shù)提供了較好的移植物選擇前景，利用組織工程方法構(gòu)建材料有望克服目前移植物的問題。種子細(xì)胞、生物材料和組織構(gòu)建是組織工程的三個基本要素。種子細(xì)胞的選擇成為韌帶組織工程的研究課題之一。目前提出作為種子細(xì)胞的選擇有皮膚成纖維細(xì)胞（SF）、內(nèi)側(cè)副韌帶細(xì)胞（MCL）、前交叉韌帶細(xì)胞（ACL），跟腱細(xì)胞（AT）。有體外實(shí)驗(yàn)表明在這四種細(xì)胞

3、中，SF在增殖能力及膠原分泌功能上都優(yōu)于MCL、ACL、AT細(xì)胞，是一種比較理想的ACL組織工程的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)使用DiI和BrdU兩種不同類型的標(biāo)記物對皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)外的標(biāo)記示蹤，并將皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)合纖維生物蛋白膠修復(fù)原位凍融的兔前交叉韌帶和未修復(fù)的凍融韌帶行對比，初步研究皮膚成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程前交叉韌帶的可行性。證明皮膚成纖維細(xì)胞是構(gòu)建組織工程前交叉韌帶較為理想的種子細(xì)胞，為組織工程化ACL的種子細(xì)胞提供

4、一種種子細(xì)胞來源。
　　第一部分：原位凍融前交叉韌帶損傷模型的建立
　　目的：為體內(nèi)修復(fù)ACL建立一種較為可靠的ACL損傷模型。
　　方法：首先使用液氮對兔ACL進(jìn)行原位凍融，使用液氮冰凍1分鐘，再在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入室溫生理鹽水浸泡3分鐘，重復(fù)上述步驟3次。
　　結(jié)果：8周后取材，HE染色表明實(shí)施原位凍融的ACL內(nèi)幾乎無細(xì)胞核存在。天狼猩紅染色顯示原位凍融的ACLⅢ型膠原明顯增加，ACL發(fā)生嚴(yán)重的退行性變。
　

5、　結(jié)論：通過以上手術(shù)方法可以為體內(nèi)修復(fù)前交叉韌帶損傷提供較為可靠的動物模型。
　　第二部分：皮膚成纖維細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究
　　目的：了解皮膚成纖維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法及其生物學(xué)特性，為采用SF進(jìn)行韌帶組織工程種子細(xì)胞的研究打下基礎(chǔ)。
　　方法：分別采用組織塊法、酶消化法分離培養(yǎng)SF，對不同代次SF細(xì)胞進(jìn)行相差顯微鏡觀察、生長曲線測定。
　　結(jié)果：酶消化法分離培養(yǎng)細(xì)胞貼壁快，傳代五次后，細(xì)胞的生長速

6、度減慢。
　　結(jié)論：酶消化法分離培養(yǎng)SF細(xì)胞更適合于組織工程，SF細(xì)胞第一～第四代可作為構(gòu)建組織工程化前交叉韌帶的種子細(xì)胞。
　　第三部分：BrdU和CM-DiI標(biāo)記示蹤SF復(fù)合纖維蛋白膠修復(fù)ACL損傷的比較研究
　　目的：探索使用BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）和CM-DiI（1，1’-雙十八烷-3，3，3’，3，-四甲基吲哚羰花青-高氯酸鹽）標(biāo)記SF的條件，比較兩種標(biāo)記方法效果及體內(nèi)示蹤的可行性。研究皮膚成纖維細(xì)胞

7、在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的存活情況，以探索SF作為構(gòu)建組織工程ACL種子細(xì)胞的可行性。
　　方法：體外分離家兔自體SF，使用熒光染料CM－DiI對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，使用熒光倒置顯微鏡觀察0，24，48，72h細(xì)胞熒光強(qiáng)度及形態(tài)變化，MTT比色法測定標(biāo)記前，后皮膚成纖維細(xì)胞的增殖狀況。使用BrdU標(biāo)記SF，并在標(biāo)記后行細(xì)胞爬片的免疫組化染色，同樣使用MTT比色法測定標(biāo)記前，后皮膚成纖維細(xì)胞的增殖狀況。分別標(biāo)記后與纖維蛋白膠復(fù)合，植入原位凍融的ACL的

8、關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并包裹在ACL周圍。12周后取材，行HE染色及免疫組化染色。
　　結(jié)果：DiI及BrdU標(biāo)記SF的標(biāo)記率良好，SF在使用DiI以及BrdU標(biāo)記前后生長無區(qū)別。DiI標(biāo)記后早期細(xì)胞形態(tài)呈熒光環(huán)狀，48h后細(xì)胞中熒光顆粒增多，熒光增強(qiáng)，細(xì)胞核未染熒光，在72h無明顯變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HE染色表現(xiàn)韌帶周邊有較多成纖維細(xì)胞聚集，周邊膠原纖維走行較好，而內(nèi)部發(fā)生嚴(yán)重的玻璃樣改變。由于在熒光顯微鏡下，膠原纖維在熒光激發(fā)下發(fā)光，Di

9、I顯色與背景色較難區(qū)分，而免疫組化染色顯示包裹在韌帶周圍的蛋白膠中有大量陽性染色團(tuán)塊存在。
　　結(jié)論：使用DiI等一類熒光標(biāo)記物在體內(nèi)示蹤方面劣勢較BrdU明顯，故BrdU在本實(shí)驗(yàn)研究中示蹤效果優(yōu)于DiI。皮膚成纖維細(xì)胞在關(guān)節(jié)腔內(nèi)可以存活，可能是一種較為可行的種子細(xì)胞來源。
　　通過以上三部分研究，明確了SF體外分離培養(yǎng)方法，了解了其體外生物學(xué)特征，探索出較為可靠的體內(nèi)標(biāo)記示蹤手段，皮膚成纖維細(xì)胞在凍融后的前交叉韌帶可以存活