卵巢癌上清誘導(dǎo)成熟樹突狀細胞亞群漂移的體外研究.pdf

1、背景： 樹突狀細胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的效能最高的專職性抗原提呈細胞，其功能多樣，但其最大的功能就是能夠刺激初始T細胞的增殖。DC能有效地內(nèi)化、加工和遞呈可溶性抗原，激發(fā)T細胞增殖生成輔助性T細胞和殺傷性T細胞并能特異性的激活細胞毒性T細胞，引起免疫應(yīng)答。DC根據(jù)其來源可分為髓系來源的DC(DC1)和淋巴系來源的DC(DC2)。DC1的功能與其成熟狀態(tài)密切相關(guān)，成熟DC1具有很強的將抗原肽提呈給未致敏的T淋巴細胞并使其活化的能力，

2、在腫瘤免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。而未成熟DC1具有很強的攝取處理抗原的能力，被稱為免疫哨兵，但其抗原提呈能力很差，往往維持穩(wěn)態(tài)環(huán)境中的免疫耐受。DC2受抗原刺激后分泌大量IFN-α，誘導(dǎo)T細胞向Th2方向分化，分泌Th2型細胞因子。DC2不是T細胞的有效刺激者，再次給予異體抗原后在體內(nèi)外可誘導(dǎo)非特異性低反應(yīng)性，誘導(dǎo)T細胞的免疫耐受，所以又稱之為調(diào)節(jié)性DC。 腫瘤患者體內(nèi)DC功能大多存在缺陷，一些腫瘤衍生因子的存在，如VEGF、M-C

3、SF、IL-6)和GM-CSF等使DC分化成熟障礙是其主要原因，致使有功能的成熟DC比例下降，不成熟DC大量積累。但近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)DC功能缺陷與外周血中DC1/DC2比例失衡有關(guān)，稱之為DC亞群漂移學(xué)說。 卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，腹腔內(nèi)廣泛播散是其主要的生物學(xué)行為和致死原因。已有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者體內(nèi)也存在這種DC亞群漂移現(xiàn)象，而我們先前研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌腹水中存在Th1向Th2漂移，癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞(

4、TIL)和腹水中腫瘤相關(guān)淋巴細胞(TAL)的腫瘤殺傷力顯著下降，提示卵巢癌患者的腹腔免疫存在缺陷，且發(fā)現(xiàn)腹腔免疫缺陷先于其全身免疫缺陷發(fā)生，據(jù)此我們猜測卵巢癌細胞可能分泌某些物質(zhì)而導(dǎo)致DC亞群漂移。因此本研究以健康人外周血白細胞來源的CDl4s細胞在體外誘導(dǎo)成的成熟DC為研究對象，用兩種卵巢癌細胞株細胞培養(yǎng)上清與DC共同培養(yǎng)，通過流式細胞儀檢測DC表面成熟標記和DC1/DC2的比例的變化，通過DC與CD3陽性T細胞共同培養(yǎng)，觀察卵巢癌上

5、清作用前后DC刺激T細胞的功能變化，證明卵巢癌細胞培養(yǎng)上清是否能使健康人外周血來源的成熟DC1向DC2漂移及引發(fā)DC功能障礙，從而為探索卵巢癌免疫治療新方法奠定理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。目的觀察兩種卵巢癌上清對健康人外周血單核細胞來源的成熟樹突狀細胞亞型和功能的影響，以進一步揭示腫瘤的免疫逃逸機制。 材料與方法： 采用健康人外周血白細胞液，體外梯度密度離心分離出單核細胞層，磁珠分選得到CD14單個核細胞，加入IL-4，GM-C

6、SF五天誘導(dǎo)成為未成熟DC，再加入TNF-α兩天誘導(dǎo)成為成熟DC，將預(yù)先準備好的兩種卵巢癌細胞培養(yǎng)上清(SKOV3，3AO)分別與上述DC共培養(yǎng)兩天，采用流式細胞術(shù)觀察腫瘤細胞上清對DC亞型，表面成熟標記表達的影響；采用同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)(Brdu-Elisa)檢測腫瘤細胞上清對DC功能的影響。 結(jié)果： 1.體外誘導(dǎo)獲得具有典型毛刺狀突起的成熟DC，其中DC1的比例約(70-90)％，DC2比例小于2％，表面．HL

7、A-DR及成熟標記CD80,CD86都有高表達。 2.SKOV3上清作用后DC1的比例為(70.46±5.72)％，與對照相(80.96± 3.65)％比，有了明顯的下降(P<0.05): DC2的比例為(1.22±0.08)％，與對照相(0.50±0.16)％比，有了明顯的上升(P<0.05)；3AO上清作用后DC1的比例為(59.68±12.02)％，與對照相(74.33±14.07)％比，有了明顯的下降(P<0.0

8、5)；DC2的比例為(2.73±1.07)％，與對照相(1.25±0.58)％比，有了明顯的上升(P<0.05)。 3.SKOV3上清作用后DC的成熟標記CD80(84.06±10.59)％與對照(74.28±15.92)％相比，有了顯著的上升(P<0.05)。成熟標記CD86(92.46±10.25)％與對照(83.94±10.87)％相比，也同樣有了顯著的上升(P<0.05)；3AO上清作用后CD80(86.25±4.52)％與對照

9、(65.90±13.30)％相比，有了顯著的上升(P<0.05)。CD86(90.50±7.34)％與對照(80.68±8.83)％相比，也同樣有了顯著的上升(P<0.05)。 4.SKOV3上清作用后DC刺激CD3+T細胞增殖的能力按DC與T細胞比例不同分別是DC:T=1:10時，實驗組SI值(4.58±0.11)，與對照組SI值(7.43±0.53)相比，顯著下降(P<0.05)；DC:T＝1:50時，實驗組SI值(2.07

10、±0.06)，與對照組SI值(5.03±0.65)相比，顯著下降(P<0.05); DC：T=1:100時，實驗組SI值(1.53±0.38)，與對照組SI值(4.08±0.94)相比，顯著下降(P<0.05)。 3AO上清作用后DC刺激CD3+T細胞增殖的能力按DC與T細胞比例不同分別是DC:T=1:10時，實驗組SI值(5.07±0.71)，與對照組SI值(6.08±1.53)相比，有下降趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05

11、); DC:T=1:50時，實驗組SI值(2.18±0.32)，與對照組SI值(4.04±0.70)相比，顯著下降(P<0.05)；DC:T=1:100時，實驗組SI值(2.04±0.35)，與對照組SI值(2.05±0.71)相比，無顯著差別(P>0.05)。 結(jié)論： 1.該實驗通過應(yīng)用rhGM-CSF+rhIL-4并與TNF-α聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)人外周血CD14單核細胞誘導(dǎo)獲得成熟DC的方法，建立了一個穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)DC的