上皮性卵巢癌細(xì)胞經(jīng)Notch1途徑影響樹突狀前體細(xì)胞亞群分化和功能的研究.pdf

1、上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian carcinoma，EOC)是致死率最高的婦科腫瘤。據(jù)報道2014年美國約有22000婦女被診斷為卵巢癌，其中超過14000婦女死亡。盡管大多數(shù)病人能在初次治療結(jié)束后獲得臨床完全緩解，但卵巢癌的預(yù)后仍不容樂觀，5年生存率僅30-40％。目前認(rèn)為卵巢癌的高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率及高死亡率，與腫瘤局部微環(huán)境免疫缺陷密切相關(guān)。導(dǎo)致EOC免疫缺陷的原因很多，包括腫瘤局部微環(huán)境中免疫抑制細(xì)胞因子增多，

2、樹突狀細(xì)胞(dentritic cells，DC)的功能缺陷，輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)中Th1/Th2平衡漂移，有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答受抑制等等，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。
　　樹突狀細(xì)胞(dentritic cells，DC)是機體抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵細(xì)胞，以往及我們前期的研究已證實DC亞群分化及功能的異常是腫瘤逃逸的重要原因。DC作為生物體內(nèi)功能最強大的專職抗原提呈細(xì)胞，根據(jù)來源可分為髓系

3、來源的DC(myeloid DC，mDC))和淋巴系來源的DC(lymphoid DC)，又稱為漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid DC，pDC)兩個亞群。成熟的mDC高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類、Ⅱ類分子、協(xié)同刺激分子等，分泌白介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)等細(xì)胞因子，促

4、進(jìn)Th1反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫激活。成熟的pDC高表達(dá)IL-3Ra(CD123)、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)，分泌大量Ⅰ型干擾素，促進(jìn)Th2反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。在腫瘤中主要表現(xiàn)為成熟DC的下降具有免疫激活功能的mDC的數(shù)量減少或功能缺陷以及具有免疫抑制功能的pDC的數(shù)量增加或功能亢進(jìn)。我們前期的研究從CD34+造血干細(xì)胞中分離得到DC的前體細(xì)胞Lin-CD45RA-DC，并發(fā)現(xiàn)在SKOV3培養(yǎng)上清的作用下該D

5、C前體細(xì)胞(Lin-CD45RA-DC)向pDC分化增加，向mDC的分化減少，進(jìn)而推測這種分化的異常可能與EOC的免疫逃逸及腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但具體機制尚不清楚(本部分內(nèi)容已經(jīng)發(fā)表在Gynecol Oncol.2009;112(1):199-204)。
　　Notch蛋白(Notch1-4)由一組高度保守的跨膜受體蛋白，由Notch基因編碼，被認(rèn)為可以決定細(xì)胞命運，其中Notch1起主要作用。目前有較多的文獻(xiàn)證實Notch1通路與卵

6、巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Chen C等報道Notch1受體mRNA的表達(dá)與卵巢癌的預(yù)后密切相關(guān)。Feng Z等報道Notch1受體參與卵巢癌微環(huán)境中的免疫逃逸。此外有關(guān)Notch1受體與DC的研究發(fā)現(xiàn)在DC細(xì)胞中存在Notch1受體及其配體的表達(dá)，Notch1信號途徑參與調(diào)節(jié)DC的分化，Hoshino N等報道活化Notch信號通路可以促進(jìn)外周血單核細(xì)胞向DC及朗格漢斯細(xì)胞分化，De Smedt等報道用γ酶抑制劑阻斷Notch1信號通路

7、后可以促進(jìn)向非T細(xì)胞包括單核細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞分化。由此，我們推測EOC細(xì)胞產(chǎn)生的各種因子可能通過Notch1信號通路的介導(dǎo)，影響了DC前體細(xì)胞的正常分化，進(jìn)而免疫逃逸，促進(jìn)了EOC的產(chǎn)生和進(jìn)展。
　　本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，利用前期已建立的體外DC分化培養(yǎng)模型，首先確定Notch1受體和配體在DC前體細(xì)胞(Lin-CD45RA-DC)中的表達(dá);其次研究EOC培養(yǎng)上清對DC前體細(xì)胞(Lin-CD45RA-DC)分化及功能的影響;再

8、分別用r-分泌酶抑制劑DAPT及短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）下調(diào)DC前體細(xì)胞(Lin-CD45RA-DC)中Notch1受體的表達(dá)，以證實Notch1信號通路對DC前體細(xì)胞(Lin-CD45RA-DC)分化及功能的影響;最后比較Notch1受體抑制前后EOC培養(yǎng)上清對Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞分化及功能的影響。旨在初步探索EOC微環(huán)境參與調(diào)節(jié)DC前體分化及功能異常的可能機制，有助于理解EOC免疫

9、逃逸機制，并為EOC的免疫治療提供新的靶點。
　　第一部分 樹突狀前體細(xì)胞中Notch1受體及配體的表達(dá)
　　目的:
　　檢測并驗證Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞中Notch1受體及配體的表達(dá)。
　　材料與方法:
　　1.足月分娩產(chǎn)婦的臍血中提取CD34+造血干細(xì)胞，擴增后并用免疫磁珠分選，獲得Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞，并建立體外DC分化培養(yǎng)模型，;
　　2.采用Real time RT

10、-PCR檢測Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞中Notch1受體及配體(Jagged1、Jagged2、Delta1)mRNA的表達(dá);
　　結(jié)果:
　　1.在Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞中，檢測到Notch1受體及其配體Jagged1、Jagged2、Delta1的mRNA的表達(dá);
　　2.Notch1受體，Jagged1高表達(dá)，Jagged2，Delta1低表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　Notch1和Ja

11、gged1在Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞中表達(dá)相對較高，而Jagged2和Delta1則相對較低，提示Notch1和Jagged1可能在Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞中發(fā)揮主要作用。
　　第二部分 上皮性卵巢癌細(xì)胞經(jīng)Notch1途徑影響樹突狀前體細(xì)胞的分化
　　目的:
　　1.研究SKOV3培養(yǎng)上清對Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞分化的影響;
　　2.研究Notch1受體抑制對Lin-CD45RA-

12、DC前體細(xì)胞分化的影響;
　　3.研究Notch1受體抑制前后SKOV3培養(yǎng)上清對Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞分化的影響;
　　材料與方法:
　　1.利用第一部分中建立的體外DC分化培養(yǎng)模型，加入SKOV3培養(yǎng)上清，流式細(xì)胞儀檢測各實驗組mDC及pDC的變化，比較SKOV3培養(yǎng)上清加入前后對Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞分化的影響;
　　2.分別采用Notch1-shRNA慢病毒或DAPT下調(diào)Lin-C

13、D45RA-DC前體細(xì)胞Notch1受體的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀檢測各實驗組mDC及pDC的變化，比較Notch1受體抑制前后對Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞分化的影響;
　　3.利用2中Notch1受體抑制的Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞，加入SKOV3培養(yǎng)上清，用流式細(xì)胞儀檢測各實驗組mDC及pDC的變化，比較Notch1受體抑制前后SKOV3培養(yǎng)上清對Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果:

14、>　　1.SKOV3培養(yǎng)上清使Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞向mDCs的分化減少(p=0.011)，向pDCs的分化增多(p=0.006);
　　2.Notch1受體表達(dá)抑制可以影響Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞的分化，向mDC的變化增多（DAPT組:P＞0.05;shRNA組:p=0.007），向pDCs的分化減少(p=0.015，p=0.007);
　　3.Notch1受體表達(dá)抑制可以部分逆轉(zhuǎn)SKOV3對Lin-

15、CD45RA-DC前體細(xì)胞向pDC的分化效應(yīng)(p=0.02，p=0.02)，但不改變其對mDC的分化效應(yīng)(p=0.25，p=0.07);
　　結(jié)論:
　　SKOV3上清可能通過Notch1信號通路影響Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞向pDC的分化。
　　第三部分 上皮性卵巢癌細(xì)胞經(jīng)Notch1途徑影響樹突狀細(xì)胞的功能
　　目的:
　　證實SKOV3培養(yǎng)上清經(jīng)Notch1途徑影響樹突狀細(xì)胞的功能。
　

16、　材料與方法:
　　1.利用第一部分中建立的體外DC分化培養(yǎng)模型，加入SKOV3培養(yǎng)上清，ELISA法比較各組分泌IL-12值的變化，比較SKOV3培養(yǎng)上清加入前后對DC功能的影響;
　　2.利用第二部分中Notch1下調(diào)表達(dá)的Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞，ELISA法比較各組分泌IL-12值的變化，比較Notch1受體抑制前后對DC功能的影響;
　　3.利用第二部分中Notch1下調(diào)表達(dá)的Lin-CD45RA-

17、DC前體細(xì)胞，加入SKOV3培養(yǎng)上清，ELISA法比較各組分泌IL-12值的變化，比較Notch1受體抑制前后SKOV3培養(yǎng)上清對DC功能的影響。
　　結(jié)果:
　　1.SKOV3培養(yǎng)上清可以促進(jìn)DC細(xì)胞IL-12分泌減少(p=0.001);
　　2.Notch1受體表達(dá)抑制可以促進(jìn)DC細(xì)胞IL-12分泌增多(p=0.0002，p=0.0002);
　　3.Notch1受體表達(dá)抑制可以部分逆轉(zhuǎn)SKOV3所致的DC分