冬凌草甲素對人胰腺癌細胞PATU8988生物學特性影響及機制的研究.pdf

1、胰腺癌發(fā)病隱匿，進展迅速，預后極差，病死率高。手術(shù)是主要治療手段，但因早期診斷困難，大部分患者確診時已無手術(shù)機會。多數(shù)病人表面上腫瘤局限，實際上微小轉(zhuǎn)移灶已經(jīng)存在。手術(shù)仍是治愈該病的主要手段。隨著新型化療藥物和方案的不斷涌現(xiàn)，放療技術(shù)及設備的明顯改進和以基因治療和免疫治療為代表的生物療法的發(fā)展，胰腺癌的治療手段更加多樣化和正規(guī)化。但是胰腺癌細胞對多數(shù)化療藥物不敏感，目前尚無滿意的治療方法。冬凌草甲素是從冬凌草等植物葉子中提取出的一種貝殼

2、杉烯二萜類化合物，具有好的抗腫瘤活性，目前是臨床應用中最重要的中草藥之一。半個世紀以前，人們就發(fā)現(xiàn)了冬凌草甲素除了抗炎作用，還具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的作用，最近研究治療表明，冬凌草甲素是非常有效的抗癌藥物，對一些惡性腫瘤如前列腺癌，乳癌，非小細胞肺癌等有很好的抗癌作用。但是其抗癌機理沒有被完全闡明。為了揭示其可能的抗癌機理，通過研究不同濃度的冬凌草甲素抑制胰腺癌細胞的增殖和對凋亡的影響以及侵襲性影響，通過測定相關(guān)基因的變化，探討冬凌草甲素

3、對人胰腺癌細胞PATU8988的生物學特性的影響及可能機制，為臨床治療胰腺癌提供依據(jù)。 一、目的 體外研究冬凌草甲素對人胰腺癌細胞株P(guān)ATU8988的生物學特性影響以及可能的作用機制。 二、方法 以人胰腺癌細胞PATU8988為體外模型，用冬凌草甲素處理該細胞，利用MTT法（四甲基偶氮唑藍）檢測冬凌草甲素對PATU8988細胞的增殖抑制作用，光學顯微鏡觀察冬凌草甲素處理后PATU8988細胞形態(tài)的改變，A

4、nnexinⅤ（標記有異硫氰酸熒光素的連接素Ⅴ）/PI（碘化丙啶）雙染色，采用流式細胞儀測定AnnexinⅤ+/PI-細胞比例，利用Rh123標記經(jīng)冬凌草甲素誘導的PATU8988細胞，F(xiàn)ACS測定線粒體膜電位（△Ψm）的改變。利用RT-PCR技術(shù)檢測相關(guān)基因P53、Bcl-2、STAT-3、VEGF、MMP-9的表達變化。 三、結(jié)果 MTT結(jié)果顯示隨著冬凌草甲素藥物濃度的增加（2，4，8，16，32，64，128mg

5、/L）和作用時間的延長，PATU8988細胞的增殖明顯受到抑制。 光學顯微鏡觀察，隨著冬凌草甲素藥物濃度的增加出現(xiàn)凋亡細胞的典型形態(tài)學特征改變：表現(xiàn)為胞漿空泡，核染色質(zhì)向核一側(cè)固縮呈現(xiàn)半月形，并可見凋亡小體，細胞體積縮小。在2mg/L作用24h基本無凋亡，8mg/L作用24h可見部分凋亡，至72h內(nèi)，凋亡現(xiàn)象明顯。128 mg/L作用8h即開始呈現(xiàn)凋亡，作用24h開始出現(xiàn)壞死。 流式細胞儀分析測定AnnexinⅤ+/PI

6、-細胞率，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素（0，8，16，32，64mg/L）作用24小時后，PATU8988細胞凋亡比率隨冬凌草甲素誘導濃度升高而增加。 FACS測定PATU8988細胞線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位降低（P<0．05）。 冬凌草甲素（4，8，16，32，64mg/L）誘導PATU8988細胞24h后，半定量分析PATU8988細胞P53、Bcl-2、STAT-3、VEGF、MMP-9 mRNA表達水平。未處理的PAT

7、U8988細胞均有Bcl-2、STAT-3、VEGF、MMP-9的mRNA表達，加入冬凌草甲素后，Bcl-2、STAT-3、VEGF、MMP-9的表達隨藥物濃度增加表達下降，而P53的mRNA表達水平，隨藥物濃度增加而上升，也呈劑量依賴。 四、結(jié)論 1．冬凌草甲素能抑制PATU8988細胞的生長，具有一定的濃度和時間依賴性。 2．能誘導PMU8988細胞凋亡，經(jīng)冬凌草甲素處理后PATU8988細胞表現(xiàn)出凋亡細胞典

8、型的形態(tài)學特征改變，流式細胞儀分析測定AnnexinⅤ陽性細胞率，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素作用24小時后，PATU8988細胞凋亡比率隨藥物濃度升高而增加。線粒體膜電位降低也說明細胞的凋亡。誘導細胞凋亡是其主要細胞毒作用之一。 3．能抑制VEGF、MMP-9的mRNA表達，從而可能降低PATU8988細胞的侵襲性。抑制STAT-3的表達，抑制增殖作用可能與此有關(guān)。 4．在細胞凋亡過程中抑癌基因P53基因上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl-2