靶向PD-L1的RNAi慢病毒在胰腺癌Patu8988細胞中的功能驗證.pdf

1、目的:
　　 檢測胰腺癌標本及正常胰腺組織中PD-L1（程序性凋亡因子-1）基因的表達差異。篩選靶向人PD-L1基因mRNA的RNAi有效干擾序列，并以此序列構建靶向PD-L1的RNA干擾慢病毒載體，轉染人胰腺癌細胞系Patu8988，驗證其對PD-L1基因的干擾效率，為進一步研究PD-L1在胰腺癌中的作用及機制提供研究基礎。
　　 方法:
　　 實驗共分兩部分：
　　 1．收集22例臨床切除的胰腺癌標本

2、，并同時以22例正常胰腺組織標本作對照，應用免疫組化方法(IHC)S-P法檢測標本中PD-L1的蛋白表達差異情況。
　　 2．根據(jù)PD-L1基因序列篩選出三個RNA干擾靶點，并以此序列設計三條shRNA序列，分別構建3個shRNA質粒表達載體，經(jīng)測序鑒定三個質粒均構建成功。三個質粒分別與過表達PD-L1的質粒載體一起轉染293T細胞，Western blotting檢測抑制效果，篩選出最有效干擾序列的質粒。以此質粒轉染293T細

3、胞，進行病毒包裝成LV-PD-L1-siRNA。滴度測定后，轉染人胰腺癌細胞系Patu8988，熒光顯微鏡觀察GFP表達，流式細胞儀(FCM)檢測轉染效率，Real-time PCR、ELISA驗證PD-L1在mRNA和蛋白水平表達的變化情況。
　　 結果：
　　 1．PD-L1在胰腺癌組織中的表達明顯高于正常胰腺組織(X2=11.023，P＜0.01)。
　　 2．構建的質粒表達載體經(jīng)PCR鑒定均可擴增出預期條

4、帶，測序證明質粒構建成功。靶向PD-L1基因的shRNA質粒對293T細胞表達PD-L1有抑制作用，其中以PD-L1-shRNA-3號序列的抑制作用最明顯。靶向PD-L1的shRNA片段成功包裝入慢病毒載體，病毒滴度為5×109TU/ml。慢病毒轉染效率達90％以上，其對人胰腺癌Patu8988細胞PD-L1在mRNA水平和蛋白水平表達的抑制效率分別為72.80%和44.66%，可以用于進一步研究實驗。
　　 結論：