抑制糖酵解途徑對胰腺癌細胞PANC-1生物學(xué)特性的影響及其機制的研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：胰腺癌組織、癌旁組織及胰腺正常組織乳酸脫氫酶活性及同工酶譜、琥珀酸脫氫酶活性表達變化
　　 目的：檢測胰腺正常組織、癌組織及癌旁組織中糖酵解關(guān)鍵酶-乳酸脫氫酶（lacatedehydrogenase，LDH）活性及其同工酶譜變化，以及琥珀酸脫氫酶（succinatedehydrogenase，SDH）活性的表達變化，分析糖酵解與胰腺癌生物學(xué)特性的關(guān)系。
　　 方法：收集我院自2

2、006年10月至2008年7月期間我院收治的12例胰腺導(dǎo)管腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本和12例胰島素瘤等良性病變及其正常胰腺組織。LDH活性檢測采用LDH檢測試劑盒；LDH 同工酶譜檢測采用法國Sebia公司的hydrasys 全自動分析儀；酶組織化學(xué)染色檢測癌組織、癌旁組織及胰腺正常組織中琥珀酸脫氫酶活性的變化。
　　 結(jié)果：與正常胰腺組織相比，癌組織及癌旁組織中LDH活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；癌組織及癌旁組織中

3、LDH 同工酶譜分析顯示LDH4、LDH5 明顯升高，與正常組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。酶組織化學(xué)染色顯示，癌組織中琥珀酸脫氫酶表達活性較癌旁組織及正常組織活性明顯降低。
　　 結(jié)論：胰腺癌有氧氧化功能降低，糖酵解水平增強，其中LDH活性及其同工酶譜的變化可能和胰腺癌的發(fā)病機理相關(guān)，特異性抑制LDH可能成為胰腺癌新的治療策略。
　　 第二部分：體外乳酸脫氫酶特異性抑制劑-草氨酸鹽(oxamate)對胰腺癌

4、細胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用
　　 目的：分析乳酸脫氫酶抑制劑-草氨酸鹽(oxamate)對人胰腺癌細胞株增殖的影響及誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 方法：MTT法觀察終濃度為0mol/L，0.02mol/L，0.04mol/L，0.08mol/L，0.1mol/L草氨酸鹽分別作用于不含血清培養(yǎng)基及含10%血清培養(yǎng)基胰腺癌PANC-1細胞株24h、48h后，檢測其對細胞增殖的抑制作用，同時行Hochest33342 及PI 染色

5、、流式細胞儀檢測草氨酸鹽對其凋亡的影響。
　　 結(jié)果：草氨酸鹽對人胰腺癌PANC-1細胞株的增殖有顯著的抑制作用，并且隨草氨酸鹽濃度增加，增殖抑制明顯增加，呈劑量依賴性，不含血清培養(yǎng)時抑制作用高于含血清組(P<0.01)，；Hochest 及PI 染色、流式細胞儀檢測均表現(xiàn)細胞凋亡比例逐漸增高，且呈劑量依賴性(P<0.01)。
　　 結(jié)論：草氨酸鹽能夠顯著抑制人胰腺癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，有可能成為治療胰腺癌的新靶點。

6、
　　 第三部分：體外抑制劑對胰腺癌細胞細胞凋亡的可能機制的研究
　　 目的：研究探討乳酸脫氫酶抑制劑-草氨酸鹽(oxamate)誘導(dǎo)胰腺癌細胞PANC-1 凋亡的可能機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人胰腺癌細胞PANC-1，不同濃度草氨酸鹽(0mol/L，0.02mol/L，0.04mol/L，0.06mol/L，0.08 mol/L，0.1mol/L)作用panc-1細胞48h，流式檢測細胞凋亡情況；鈣離子熒光指

7、示劑Fluo-3/AM 染色，激光共聚焦下觀察不同濃度草氨酸鹽作用下細胞內(nèi)鈣含量的變化；羅丹明123(Rhodamine 123,Rh123)單染、Rh123 聯(lián)合PI 雙染聯(lián)合檢測細胞線粒體膜電位的變化；
　　 結(jié)果：草氨酸鹽干預(yù)胰腺癌細胞48h后，細胞凋亡比例逐漸增高，細胞內(nèi)鈣含量隨著草氨酸鹽濃度的升高，熒光強度也逐漸增強，呈劑量—效應(yīng)關(guān)系；0.02mol/L～0.06mol/L的草氨酸鹽干預(yù)時，羅丹明單染顯示細胞線粒體膜電

8、位逐漸增高，而0.08mol/L～0.1mol/L的草氨酸鹽時，線粒體膜電位則出現(xiàn)明顯下降的趨勢，Rh123-/PI-細胞百分比明顯增加(p<0.05)，0.1mol/L時已為(8.94±0.13)%；
　　 結(jié)論：糖酵解抑制劑-草氨酸鹽能夠有效的誘導(dǎo)胰腺癌PANC-1細胞的凋亡。草氨酸鹽可能通過增加胰腺癌細胞內(nèi)鈣離子含量，影響細胞內(nèi)鈣離子平衡，低濃度組主要通過抑制細胞能量代謝而誘導(dǎo)凋亡，而0.08mol/L和0.1mol/L的

9、高濃度組還可能通過降低細胞線粒體膜電位，進而激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)其凋亡。
　　 第四部分：LDH-A shRNA對人胰腺癌細胞增殖凋亡和LDH-A表達、乳酸脫氫酶活性的影響
　　 目的：腫瘤組織糖酵解增強，而乳酸脫氫酶催化丙酮酸氧化生成乳酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，乳酸脫氫酶A(lactate Dehydrogenase,LDH-A)與乳酸脫氫酶B(LDH-B)基因分別編碼M 亞基和H 亞基，M、H 亞基比例不同而表現(xiàn)

10、為同工酶LDH1-5。本研究通過構(gòu)建LDH-A shRNA，轉(zhuǎn)染PANC-1細胞，分析其對胰腺癌細胞生物學(xué)特性的影響。
　　 方法：構(gòu)建3條LDH-A shRNA 質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至PANC-1細胞中，實時熒光定量PCR法檢測不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后LDH-A mRNA的表達變化。將抑制效率最高的shRNA質(zhì)粒-3轉(zhuǎn)染PANC-1細胞，MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞增殖的變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。RT-PCR檢測LDH-A表達以及

11、酶化學(xué)染色檢測轉(zhuǎn)染前后LDH活性的變化。
　　 結(jié)果：3種LDH-A shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞后，LDH-A shRNA 質(zhì)粒-3的2-△△Ct值為(0.47±0.02)，較正常細胞的(0.71±0.01)小，存在抑制作用，且抑制效率較最高。
　　 PANC-1細胞在轉(zhuǎn)染shRNA 質(zhì)粒-3后12h 就出現(xiàn)轉(zhuǎn)染組吸光度值顯著低于對照組，細胞出現(xiàn)增殖抑制，24h、36h、48h和72h，轉(zhuǎn)染組的吸光度值均顯著低于對照