松質(zhì)骨-水凝膠支架構(gòu)建類骨軟骨復(fù)合物.pdf

1、軟骨組織結(jié)構(gòu)簡單，無血管神經(jīng)長入，因此自身修復(fù)能力有限。傳統(tǒng)的軟骨缺損治療方法各有局限性且不能完全恢復(fù)軟骨組織的功能性，因此，利用組織工程方法構(gòu)建骨軟骨仿生組織復(fù)合物是未來解決大面積骨軟骨缺損的最佳方法之一。本實(shí)驗(yàn)采用生物相容性強(qiáng)、與人體骨組織結(jié)構(gòu)及性能相似的豬源骨松質(zhì)脫脂、脫鈣、脫蛋白后作為骨部分仿生支架，將殼聚糖明膠混合凍干并交聯(lián)后構(gòu)建殼聚糖-明膠水凝膠支架作為軟骨部分仿生支架。在構(gòu)建的水凝膠/松質(zhì)骨支架上分別接種骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞方向

2、誘導(dǎo)分化后的脂肪干細(xì)胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCs)后，構(gòu)建雙層骨軟骨復(fù)合物并檢測其用于骨軟骨修復(fù)中的可行性。
　　首先，制備骨松質(zhì)支架，檢測其孔徑分布、孔隙率，掃描電鏡觀察其表面形貌并利用紅外檢測其化學(xué)組成。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)骨松質(zhì)支架表面有大量納米級突起，骨松質(zhì)支架內(nèi)孔道連通，支架的平均孔徑為410±59μm，孔隙率為70.64±1.71％。通過紅外檢測發(fā)現(xiàn)，骨松質(zhì)支架內(nèi)含有羥基磷灰石與蛋白質(zhì)等

3、有機(jī)物質(zhì)。制備不同濃度的殼聚糖/明膠水凝膠支架并檢測不同濃度下支架的孔隙率、溶脹率及降解率，選擇綜合性能最優(yōu)的濃度用于制備本實(shí)驗(yàn)所需的水凝膠支架。觀察最佳濃度組水凝膠支架的孔徑、微觀形貌并用紅外檢測分析交聯(lián)前后殼聚糖/明膠的化學(xué)組成變化。本研究水凝膠中明膠與殼聚糖的質(zhì)量比為3∶1，設(shè)置3％，4％，5％三組不同濃度的水凝膠。經(jīng)相關(guān)物理性能檢測，發(fā)現(xiàn)4％濃度組水凝膠支架的孔隙率、溶脹率及降解率等綜合性能最優(yōu)，最適合作為軟骨仿生支架。4％濃度

4、組水凝膠支架內(nèi)孔道間相互連通，水凝膠的平均孔徑為117±21μm，孔隙率為83.40±0.79％，溶脹率為362.00±2.38％，PBS浸泡法測得6周后支架剩余重量為起始干重的80.76±1.6％。紅外檢測表明水凝膠支架交聯(lián)后明膠與殼聚糖的官能團(tuán)發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。骨松質(zhì)支架與水凝膠支架的各項(xiàng)物理性能與原位骨軟骨組織的物理性能相似。此外，松質(zhì)骨及殼聚糖/明膠還具有良好的生物相容性。
　　種子細(xì)胞采用分離純化后的人ADSCs，體外培養(yǎng)

5、擴(kuò)增并向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，檢測細(xì)胞的生長狀況、形態(tài)變化，并用常規(guī)染色檢測分化效果。分離純化后的ADSCs呈長梭形貼壁生長，增殖速度快，5～6天可傳代一次。脂肪培養(yǎng)中誘導(dǎo)培養(yǎng)兩周后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，油紅染色可見細(xì)胞內(nèi)有紅色小油滴。軟骨培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)三周后，甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞分泌的多糖類胞外基質(zhì)被染為淡紫色。骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組的ALP染色、vonKossa染色及茜素紅染色均呈現(xiàn)陽性，而對照組不被染色或染色不

6、明顯。綜合以上可得，ADSCs擴(kuò)增速度快、一定代數(shù)范圍內(nèi)形態(tài)穩(wěn)定，可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞，適于作為骨軟骨復(fù)合物構(gòu)建的種子細(xì)胞。
　　在兩部分支架材料制備及性能檢測與種子細(xì)胞擴(kuò)增及分化能力檢測的基礎(chǔ)上，將種子細(xì)胞與支架復(fù)合構(gòu)建骨軟骨復(fù)合物。首先將誘導(dǎo)分化后的ADSCs以1×107cells/mL的密度分別接種在骨松質(zhì)及水凝膠支架上，孔板內(nèi)分離培養(yǎng)兩周后構(gòu)建骨軟骨復(fù)合物。復(fù)合物的構(gòu)建分為三組:雙層仿生支架復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組，

7、分離培養(yǎng)對照組及空白支架組。共培養(yǎng)兩周后，倒置顯微鏡下觀察支架內(nèi)的細(xì)胞生長狀態(tài)，Dead/Live熒光染色觀察細(xì)胞在支架上的生長增殖狀態(tài)并用IpWin5軟件分析染色情況及細(xì)胞活性，茜素紅染色觀察骨松質(zhì)支架上的骨向分化能力情況。掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組水凝膠支架及骨松質(zhì)支架上細(xì)胞的生長貼附狀態(tài)及胞外基質(zhì)分泌情況。共培養(yǎng)后，倒置顯微鏡檢查結(jié)果表明ADSCs在支架上黏附良好，可見不同尺寸的細(xì)胞群落。IpWin5軟件分析Dead/Live熒光染色的光

8、密度及染色面積，t-檢驗(yàn)檢測顯著性。軟骨支架上實(shí)驗(yàn)組與對照組的累計(jì)光密度分別為350059dpi、163129dpi，P＜0.005。骨支架上實(shí)驗(yàn)組與對照組的累計(jì)光密度分別為306222dpi、31595dpi，P＜0.005。骨支架上實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞的熒光染色面積分別為14815.10μm2、1412.13μm2，P＜0.005。軟骨支架上實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞的熒光染色面積分別為16836.96μm2、7829.27μm2，P＜0.0

9、05。復(fù)合支架組（實(shí)驗(yàn)組）的細(xì)胞熒光染色面積及累計(jì)光密度與對照組有顯著性差異，表明實(shí)驗(yàn)組比單層培養(yǎng)對照組的細(xì)胞生長增殖能力強(qiáng)。茜素紅染色結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組骨松質(zhì)支架上的染色比對照組深。用掃描電鏡觀察構(gòu)建的復(fù)合物發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長在水凝膠及骨松質(zhì)支架的孔道內(nèi)，以細(xì)胞集簇的方式存在。骨松質(zhì)支架上可見無機(jī)鹽及骨晶等胞外分泌物，水凝膠支架表面亦可見大量分泌物。以上檢測表明，雙層支架構(gòu)建的骨軟骨復(fù)合物比單層仿生支架的構(gòu)建效果好，因此，本實(shí)驗(yàn)中制備的雙層支架