模擬微重力環(huán)境下層狀修復(fù)體體外構(gòu)建骨軟骨復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷一直是骨科面臨的難題之一。關(guān)節(jié)軟骨本身缺乏營養(yǎng)血管，再生細(xì)胞和體液因子少，軟骨的細(xì)胞/基質(zhì)比低，一旦關(guān)節(jié)軟骨損傷，其再生能力十分有限。此外，再生軟骨的生物化學(xué)和機(jī)械性能不等同于正常軟骨，容易退變和侵蝕。組織工程修復(fù)軟骨手段的目的是將修復(fù)物質(zhì)運(yùn)送到受損部位并且固定于該位置以達(dá)到有效的修復(fù)。從研究結(jié)果來看，雖然研究者們應(yīng)用了多種研究方法、生物材料、種子細(xì)胞和修復(fù)方法，但修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的長期效果并不令人滿意，存在著組織工程軟骨中心強(qiáng)

2、度低、難以和宿主正常軟骨整合、軟骨和軟骨下骨的斷裂分層問題等難題[1-3]。 研究目的: 通過最近新興的模擬微重力技術(shù)，將軟骨組織工程中應(yīng)用廣泛的膠原、殼聚糖與β-TCP有機(jī)復(fù)合，模仿體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的分層結(jié)構(gòu)，構(gòu)建層狀梯度復(fù)合材料，并將擴(kuò)增的兔擴(kuò)增的經(jīng)成骨誘導(dǎo)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞植入其中體外培養(yǎng)，觀察軟骨細(xì)胞在膠原/殼聚糖/β-磷酸三鈣層狀

3、梯度修復(fù)體中的黏附、增殖、生長情況及生物學(xué)性狀變化，以評價(jià)微重力培養(yǎng)方法在軟骨組織工程的實(shí)用性及該復(fù)合材料作為關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架的可行性。 研究方法: 以細(xì)胞和支架材料為實(shí)驗(yàn)對象，以普通培養(yǎng)和微重力培養(yǎng)分兩組對照。MTT實(shí)驗(yàn)分組：7個時(shí)間組：1天、4天、7天、10天、13天、17天、19天；8個平行孔/組，兩培養(yǎng)組共112孔。 1.成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)和軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)：用全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)新西蘭兔原代BMSCs，體

4、外擴(kuò)增后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，3周后檢測細(xì)胞堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)生成情況：取新西蘭幼兔的關(guān)節(jié)軟骨消化培養(yǎng)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增，取2、3代細(xì)胞行s-100細(xì)胞免疫化學(xué)染色。 2.種子細(xì)胞和材料復(fù)合：將誘導(dǎo)成功后的成骨細(xì)胞和前4代軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞與修復(fù)體復(fù)合體外普通培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀模擬微重力培養(yǎng)，進(jìn)行MTT檢測比較兩組細(xì)胞增殖情況并觀察模擬微重力對細(xì)胞的影響；培養(yǎng)3w后行掃描電鏡檢查觀察軟骨細(xì)胞在修復(fù)體材料內(nèi)黏附生長情況；3w后，細(xì)胞

5、和材料復(fù)合物進(jìn)行脫鈣、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色，觀察成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的生物學(xué)性狀變化及模擬微重力對復(fù)合物的力學(xué)影響。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：MTT實(shí)驗(yàn)中，相同時(shí)間點(diǎn)兩組之間的比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；同組不同時(shí)間點(diǎn)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析（One-way ANOVA）；兩組整體之間比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。α=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 研究結(jié)果: 1.細(xì)胞形態(tài)

6、：初接種時(shí)BMSCs呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中，24h后開始貼壁，細(xì)胞呈長梭形，少量多角形，約1周左右細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶。加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液后細(xì)胞生長相對緩慢，其形態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)胞逐漸增大，進(jìn)而出現(xiàn)重疊生長。2周后細(xì)胞間可見圓形或卵圓形的鈣化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍細(xì)胞呈放射狀分布。堿性磷酸酶染色陽性，Von Kossa法檢測出鈣化結(jié)節(jié)。體外單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中，5h后開始貼壁，細(xì)胞呈扁平狀，大多數(shù)三角形，少量多角形，約1周細(xì)胞鋪滿

7、培養(yǎng)瓶，呈“鋪路石”樣。第2、3代細(xì)胞S-100免疫細(xì)胞化學(xué)染色胞漿內(nèi)呈陽性反應(yīng)。 2.細(xì)胞/支架光鏡下觀察：細(xì)胞懸液滴加于經(jīng)預(yù)濕處理的復(fù)合支架材料上，支架材料迅速膨脹，證明細(xì)胞擴(kuò)散到支架內(nèi)。接種24h后，倒置顯微鏡下見材料不透明，無法觀察其內(nèi)細(xì)胞生長情況，但可見大量成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞貼附在材料旁培養(yǎng)板內(nèi)。 3.MTT檢測：種子細(xì)胞和材料復(fù)合后，除第1天兩組之間無顯著性差異外（P=0.878），其余時(shí)間點(diǎn)兩組之間有顯著性

8、差異（P<0.05），模擬微重力組明顯比培養(yǎng)板組細(xì)胞增殖力高。兩組之間整體比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），證明模擬微重力對成骨細(xì)胞在修復(fù)體內(nèi)的增殖比普通培養(yǎng)起到了更好的促進(jìn)作用。 4.掃描電鏡：培養(yǎng)3w后，普通培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞成團(tuán)地吸附于支架表面，從切開的材料上可以觀察到有部分細(xì)胞吸附于空隙內(nèi)，細(xì)胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上；模擬微重力培養(yǎng)組中細(xì)胞在修復(fù)體上分布更加均勻，且其中心部位軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯比普

9、通培養(yǎng)組多。 5.HE染色和免疫學(xué)檢測結(jié)果：3w后，HE染色顯示培養(yǎng)板組的細(xì)胞多聚集在修復(fù)體表面，細(xì)胞數(shù)量明顯多于修復(fù)體內(nèi)部，而模擬微重力組材料表面和材料內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量相差不大，分布較均勻，修復(fù)體內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量明顯比普通培養(yǎng)組多。兩組免疫組織化學(xué)染色顯示：細(xì)胞團(tuán)中有基質(zhì)分泌，沉積于細(xì)胞周圍；含有β-TCP端Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色陽性，不含有β-TCPⅡ型膠原免疫組織化學(xué)染色示胞漿內(nèi)呈陽性反應(yīng)。免疫熒光染色檢測顯示同一層狀修復(fù)體上成

10、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞同時(shí)增殖，無明顯分界。 結(jié)論: 1.成功培養(yǎng)出兔原代軟骨細(xì)胞和BMSCs，并成功誘導(dǎo)BMSCs為成骨細(xì)胞，為進(jìn)一步的細(xì)胞和材料的接種提供了數(shù)量充足和生物學(xué)性能良好的種子細(xì)胞。 2.膠原/殼聚糖/β-TCP層狀梯度復(fù)合體模擬了正常關(guān)節(jié)軟骨分層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞相容性好，能提供細(xì)胞生長的三維環(huán)境。 3.軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞聯(lián)合種植在同一修復(fù)體上，體外構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，為進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)提供的基礎(chǔ)。