一體化關節(jié)軟骨-骨復合修復材料的實驗研究.pdf

1、關節(jié)軟骨損傷是臨床上的常見病，由于關節(jié)軟骨缺乏血液循環(huán)和神經(jīng)支配，其自行修復能力有限。骨軟骨聯(lián)合缺損常影響到關節(jié)的機械穩(wěn)定性，從而增加骨性關節(jié)炎發(fā)生的危險。因此，研究開發(fā)合適的骨軟骨移植替代材料具有廣泛的現(xiàn)實意義。本研究從以下幾個方面對一種新型骨軟骨一體化移植修復材料進行了探索，材料的一體化設計可有效解決移植物的軟骨與骨部分的整合問題，同時材料的分層結構又分別適合相應的軟骨或骨組織的生長分化。
　　1.膠原/殼聚糖/納米TCP一體

2、化骨軟骨層狀修復體的孔隙結構和細胞相容性研究
　　目的：對膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復體作為組織工程支架材料的孔隙結構和細胞相容性進行檢測和評估。
　　方法：以膠原、殼聚糖、納米TCP為基本材料，通過無毒交聯(lián)和冷凍干燥方法制備膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復體。以體積法測定支架材料的孔隙率，掃描電鏡觀察材料的孔隙結構及孔徑大小。原代培養(yǎng)兔骨髓基質干細胞（MSC），傳至第二代后以3.0×105個/m

3、l的細胞濃度接種于材料，MTT法于接種后2、4、6、9、12d測細胞在材料上的生長曲線。2w后掃描電鏡觀察細胞在材料上的粘附情況。
　　結果：通過體積法測定材料的孔隙率為95％，SEM可以觀察到支架材料具有疏松多孔結構，孔隙結構規(guī)則，孔徑100～150μm，材料內部孔與孔之間貫通良好；納米TCP被包裹在修復體表面，兩者結合緊密，顆粒分布較為均勻。MSC在材料上增殖迅速，細胞基本呈現(xiàn)對數(shù)生長趨勢。SEM顯示MSC在材料上經(jīng)三維培養(yǎng)1

4、4d后生長狀態(tài)良好，細胞成片地粘附于支架表面及孔隙側壁,并可見細胞間通過突起相互連接成片。
　　結論：膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復材料具有良好的孔隙結構和孔隙率，細胞在材料上能夠很好的粘附和生長，并且增殖迅速，有望成為一種新型組織工程支架材料。
　　2.膠原/聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復體的體外三維軟骨誘導和異位成軟骨實驗
　　目的：探索膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復材料接種MSC

5、后體外三維成軟骨誘導的可行性。
　　方法：2月齡日本大耳白兔8只，分別抽取其雙側頸骨平臺下方骨髓，密度梯度離心法分離MSC，原代培養(yǎng)。待細胞傳至第二代，以2×106個/ml的濃度接種于支架材料，24孔板內培養(yǎng)，隨即培養(yǎng)液更換為含rhTGFβ110μg/L、地塞米松1×107mol/L、VitC50μg/L、新生牛血清100mL/L的軟骨誘導液。2w后取材料-細胞復合物切片，HE、甲苯胺蘭染色觀察材料內部的細胞生長情況和誘導分化情況

6、；其余材料自體回植于兔股部肌袋。6w后取材，HE染色、甲苯胺蘭染色、II型膠原免疫組化染色進一步鑒定細胞在體內的分化效果。
　　結果：MSC在體外三維軟骨誘導培養(yǎng)過程中增殖迅速，切片染色可見細胞呈多層覆蓋于材料表面及內部孔壁，部分細胞生長成團，甲苯胺蘭染色可見材料內的細胞大部分呈現(xiàn)陽性，支架材料部分降解，但總體結構無明顯改變。經(jīng)體外誘導2w后的細胞/材料復合物自體肌袋埋植6w后，可見支架材料大部分降解，軟骨樣組織在材料內部形成，甲

7、苯胺蘭和免疫組化染色均呈現(xiàn)陽性。
　　結論：膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復材料接種MSC后可被三維誘導向軟骨分化，并保持旺盛的增殖能力。經(jīng)誘導2w的細胞材料復合物植入自體骨部肌袋后，能進一步向軟骨方向分化。
　　3.復合bBMP骨軟骨修復材料的研制
　　目的：將具有高效成骨、成軟骨活性的牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bBMP）復合入材料當中，以增強材料的生物活性。
　　方法：稱取bBMP40mg，溶于4ml4M

8、鹽酸胍。將膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復體浸泡于bBMP溶液中，排盡材料內部氣泡。將充分吸附bBMP溶液的材料打包于透析膜內，對蒸餾水透析4d，而后冷凍干燥12h，環(huán)氧乙烷消毒備用。取3塊復合bBMP的材料噴金后行掃描電鏡觀察。取6塊復合bBMP的材料以1×106個/ml的細胞濃度接種兔MSC，2w后掃描電鏡觀察細胞在材料上的粘附和生長情況。
　　結果：材料復合bBMP后大體形狀及孔隙結構與復合前無異，掃描電鏡可以清

9、楚觀察到材料表面及孔隙內部有絲絮狀bBMP薄膜，MSC在生物材料上生長迅速，黏附良好，材料的表面及孔隙內部均有大量MSC生長。
　　結論：應用透析方法制備的生物材料保持了良好的結構，具有良好的細胞相容性，同時理論上將大大提高材料的生物學性能。
　　4.復合bBMP骨軟骨修復材料用于兔關節(jié)骨軟骨缺損修復的初步研究
　　目的：以復合bBMP的生物活性材料修復兔關節(jié)軟骨缺損，驗證材料的生物活性。
　　方法：2.5±0.

10、2kg體重日本大耳白兔8只，在雙側股骨髁間窩處制造直4mm深達髓腔下的缺損。將8塊復合bBMP的骨軟骨修復材料分別植入右側缺損作為實驗組，4塊不含bBMP的膠原/殼聚糖/納米TCP一體化層狀修復體植入左側缺損作為對照組1，其余4個左側缺損曠置作為對照組2。12周后取材，大體觀察及切片染色觀察缺損修復情況。
　　結果：12周后，實驗組骨軟骨缺損被白色透明組織覆蓋，與周圍軟骨連接緊密，已無明顯分界線；對照1骨軟骨缺損內為白色纖維樣組織

11、填充，缺損輪廓依然明顯；對照2缺損依然較深，中心僅少量組織填充。鏡下實驗側HE染色顯示透明軟骨形態(tài)，甲苯胺蘭染色顯示新生組織軟骨表型明顯，軟骨下骨修復良好；對照1缺損表面以纖維樣組織修復，軟骨下骨已經(jīng)基本修復；對照2仍有較深的缺損，缺損頂部覆以纖維樣組織。
　　結論：膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復體復合bBMP后具有較強的生物活性，能在早期較好的修復骨軟骨聯(lián)合缺損。
　　以上研究結果表明，膠原/殼聚糖/納米TC