靶向Egf17表達(dá)RNAi干擾抑制腎細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的實(shí)驗研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中最致命的惡性腫瘤。腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移是造成病人死亡的主要原因之一，但其轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制目前尚不十分明確。腫瘤血管生成與腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系的研究已成為對實(shí)體腫瘤研究的熱點(diǎn)問題之一。研究表明，腎癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移是一個多環(huán)節(jié)、多步驟的動態(tài)過程，涉及癌細(xì)胞的黏附、降解、移動和血管生成等多發(fā)事件。
　　類表皮生長因子域7(Egfl7)的研究涉及血管形成過程中成管這一關(guān)鍵性的步驟。由內(nèi)皮細(xì)胞及其原始細(xì)胞分泌產(chǎn)生，E

2、gfl7因子被血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌后停留在其附近，表明其可能跟細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)，介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用。
　　RNA干擾(RNAi)是近年發(fā)現(xiàn)的生物進(jìn)化上的一種防御機(jī)制，其機(jī)制是一些小的與靶基因同源互補(bǔ)的雙鏈RNA，特異性降解靶mRNA，在mRNA水平特異性抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，從而使其基因表達(dá)沉默、相應(yīng)功能表型缺失，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。自從RNAi技術(shù)誕生以來，作為基因沉默的一種新技術(shù)不僅在基因功能分析、病毒學(xué)研究領(lǐng)域獲得

3、較大進(jìn)展。
　　我們采用免疫組化、Western-bolt檢測Egfl7在腎癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，通過構(gòu)建全長的逆轉(zhuǎn)錄病毒SiRNA-Egfl7質(zhì)粒，干預(yù)沉默人腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Egfl7的表達(dá)，研究對腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，通過裸鼠成瘤、血管成管模型，驗證Egfl7調(diào)控新生血管成管的作用導(dǎo)致腫瘤生物學(xué)行為的改變。旨在闡明Egfl7在腎癌新生血管生成的重要作用，為腎癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。
　　目的：

4、r>　　1、探討Egfl7在腎細(xì)胞癌組織的表達(dá)及意義;
　　2、構(gòu)建靶向沉默Egfl7的表達(dá)對腎細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、采用免疫組化的方法檢測82例腎細(xì)胞癌組織中Egfl7蛋白的表達(dá)，結(jié)合臨床病理資料分析，研究Egfl7的表達(dá)與臨床病理特征及微血管密度(MVD)的關(guān)系。
　　2、通過構(gòu)建全長的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSUPER-Egfl7-siRNA質(zhì)粒，通過鑒定后，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到PT67細(xì)

5、胞培養(yǎng)，獲得分泌Egfl7蛋白病毒血清，干預(yù)沉默人腎癌細(xì)胞株786-0和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HMEC-1)中Egfl7的表達(dá)，體外采用劃痕實(shí)驗、Transwell侵襲實(shí)驗、血管成管實(shí)驗、MTT、流式細(xì)胞儀檢測和裸鼠成瘤實(shí)驗等方法，研究Egfl7調(diào)控腎癌細(xì)胞分化增殖、侵襲、運(yùn)動和腎細(xì)胞癌血管成管的分子機(jī)制，驗證Egfl7通過調(diào)控腎細(xì)胞癌血管成管的作用導(dǎo)致腫瘤生物學(xué)行為的改變。
　　結(jié)果：
　　1、Egfl7在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)<

6、br>　　Egfl7蛋白陽性表達(dá)為棕黃色或棕褐色顆粒，絕大多數(shù)位于細(xì)胞漿內(nèi)。82例臨床腎癌標(biāo)本中，Egfl7陰性25例，陽性57例，陽性表達(dá)率為69.5％。采用Mann-Whitney U檢驗分析Egfl7蛋白與RCC的臨床病理特征的關(guān)系， Egfl7表達(dá)與患者年齡、性別之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義，與腫瘤分期(P=0.002)、分級(P=0.022)有關(guān)，且染色強(qiáng)度隨著cTNM分期和Fuhrman核分級的升高而增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0

7、.05)。
　　2、Egfl7在腎癌細(xì)胞株的表達(dá)水平檢測
　　Western-blot方法檢測了Egfl7蛋白在腎癌細(xì)胞株786-0及肺癌A549細(xì)胞株中的表達(dá)，結(jié)果顯示:Egfl7蛋白在腫瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)，且和HUVEC細(xì)胞表達(dá)無顯著性差異(P=0.324)，此結(jié)果提示Egfl7作為一種分泌蛋白，可能由腎癌細(xì)胞分泌，參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動和血管生成等腫瘤生物學(xué)作用。
　　3、Egfl7與MVD的關(guān)系

8、　　Egfl7表達(dá)陰性的組織MVD值為79.4±27.2，顯著低于Egfl7表達(dá)陽性的組織MVD值127.3±31.3(P=0.001)。且MVD和Egfl7的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.875，P=0.003)。
　　4、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小RNA干擾特異性沉默人腎癌細(xì)胞株786-0中Egfl7的表達(dá)
　　人腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Egfl7RNAi+中Egfl7的表達(dá)被明顯抑制，較對照組而言，其抑制效率超過70％(P＜0.05)

9、，而作為對照的人腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Egfl7RNAi-中Egfl7的表達(dá)無明顯變化。以上結(jié)果提示本研究中采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小RNA干擾能夠有效特異的沉默人腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞中Egfl7的表達(dá)。
　　5、體外實(shí)驗中抑制Egfl7的表達(dá)可以抑制腎癌細(xì)胞的侵襲遷移而不影響其增殖和凋亡
　　腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Egfl7RNAi+較腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Egfl7RNAi-細(xì)胞遷移能力明顯下降，24小時劃痕愈合率

10、分別為62％ vs77％，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。用Transwell侵襲小室測定法比較兩者的侵襲能力，結(jié)果顯示腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Egfl7RNAi+較腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Egfl7RNAi-細(xì)胞侵襲能力明顯下降，24小時培養(yǎng)后穿過Transwell的每低倍視野細(xì)胞數(shù)分別為63±11 vs129±13，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。用MTT法比較腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Egfl7RNAi+較腎癌細(xì)胞株786-

11、0細(xì)胞Egfl7RNAi-的增殖能力，結(jié)果顯示兩組細(xì)胞增殖能力差異不具有顯著性意義(P＞0.05);進(jìn)而采用AnnexinⅤ和PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測凋亡情況，結(jié)果顯示兩組細(xì)胞的凋亡差異不具有顯著性意義(P＞0.05)。這些結(jié)果提示在體外實(shí)驗中抑制Egfl7的表達(dá)可以抑制抑制腎癌細(xì)胞的侵襲遷移而不影響其增殖和凋亡。
　　6、體內(nèi)抑制Egfl7的表達(dá)可以抑制腎癌細(xì)胞的成瘤能力
　　比較MiceEgfl7RNAi+和Mi

12、ce Egfl7RNAi-兩組裸鼠模型中原發(fā)瘤的大小，結(jié)果顯示皮下種植45天后原發(fā)瘤的大小(cm3)分別為3.01±0.22和3.45±0.23，差異具有顯著性意義(P＜0.05)，比較MiceEgfl7RNAi+和Mice Egfl7RNAi-兩組裸鼠模型原發(fā)瘤中的MVD，結(jié)果顯示MiceEgfl7RNAi+和Mice Egfl7RNAi-兩組平均MVD值分別為29±2和37±3，差異具有顯著性意義(P＜0.05)，這提示體內(nèi)抑制Eg

13、fl7的表達(dá)能夠抑制腎癌的生長可能與抑制腫瘤血管生成有關(guān)。
　　7、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小RNA干擾特異性沉默HMEC-1人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Egfl7的表達(dá)
　　人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1Egfl7RNAi+中Egfl7的表達(dá)被明顯抑制，而作為對照的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1Egfl7RNAi-中Egfl7的表達(dá)無明顯變化。以上結(jié)果提示本研究中采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小RNA干擾能夠有效特異的沉默人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1中

14、Egfl7的表達(dá)。
　　8、體外實(shí)驗中抑制Egfl7的表達(dá)可以抑制HMEC-1人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成
　　HMEC-1 Egfl7RNAi+內(nèi)皮細(xì)胞不能在Matrigel上形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);對照組管腔數(shù)為22.67±2.52，實(shí)驗組管腔數(shù)為7.67±0.58，兩組差異具有顯著性意義(P＜0.05)。三維血管新生模型對照組和實(shí)驗組中每10個微載體成管數(shù)分別為45±9和9±7，差異具有顯著性意義(P＜0.05)，這些結(jié)果說明體外