姜黃素干預(yù)長鏈非編碼RNA HOTAIR介導腎細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)為泌尿系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率約5～10/10萬，且每年以2％的速度遞增。RCC約占全身惡性腫瘤的3％，占腎臟原發(fā)性惡性腫瘤的85％，其死亡率超過40％。早期RCC患者手術(shù)切除后，仍有20％-30％將發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性RCC預(yù)后較差，中位生存期6～12個月，5年生存率僅9％。因此，侵襲性轉(zhuǎn)移是RCC患者治療失敗的主要原因，所以有效控制侵襲轉(zhuǎn)移是治療RCC

2、的關(guān)鍵。
　　HOX家族中LncRNA-HOTAIR是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式作用的長鏈非編碼RNA(longchain noncoding RNA，LncRNAs)，它能同時結(jié)合多梳抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex2，PRC2)和組蛋白去甲基化酶復(fù)合體[賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysinespecific demethylase1，LSD1)/RE1-沉默轉(zhuǎn)錄因子(RE1-silencin

3、g transcription factor，REST)共阻抑蛋白(Co-repressor of REST，CoREST)/REST]，并介導這2種復(fù)合體結(jié)合到特異性的基因組位點，分別使染色體組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(histone H3tri-methylated at lysine27，H3K27me3)和組蛋白H3第4位賴氨酸二甲基化(histone H3dimethyl Lys4，H3K4me2)，繼而導致基因沉默。<

4、br>　　近年來的研究表明，HOTAIR通過調(diào)控組蛋白的甲基化或乙酰化修飾作用介導了乳腺癌、肝癌和結(jié)腸癌腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。還有研究發(fā)現(xiàn):在腎癌樣本中可檢測到HOX基因表達異常，同時，組蛋白異常的甲基化和乙?；瘏⑴c了腎癌侵襲轉(zhuǎn)移，這提示HOX基因表達異常和組蛋白的異常乙?；赡苁悄I癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程的重要事件之一;現(xiàn)已明確姜黃素可以通過干擾組蛋白糾正組蛋白異常的甲基化和乙酰化來發(fā)揮抗癌作用。而其深入的機制如何，目前尚不清楚。因此，文

5、本假設(shè)姜黃素通過干擾HOTAIR介導組蛋白乙?；瘡亩种颇I癌侵襲轉(zhuǎn)移。
　　目的：
　　本研究擬檢測HOTAIR在腎癌組織中的表達水平，并從體內(nèi)外研究HOTAIR對腎癌細胞增殖和趨化運動遷移能力的影響。在此基礎(chǔ)上，研究姜黃素對HOTAIR介導的RCC增殖和細胞遷移運動能力的影響。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取出來的一種酚類色素，近年來的研究表明，姜黃素不僅具有抗凝、降血脂、抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗類風濕、保肝利

6、膽護胃等多方面作用，而且能夠抑制惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，但具體機制尚未闡明。本文對姜黃素是否能影響HOTAIR介導的腎癌遷移運動能力進行了研究，以期對臨床應(yīng)用姜黃素治療轉(zhuǎn)移性RCC以及靶向治療等研究提供新思路和新靶點。
　　方法：
　　1.預(yù)實驗:收集17例臨床手術(shù)標本（每例均包括腎癌原發(fā)灶、腎門轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)病灶、癌旁正常腎組織），檢測HOTAIR的表達情況，考察腎門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、腎癌組織、癌旁腎組織中的HOTAIR是否表達及其

7、差異。
　　2.考察實驗室常用的6種人腎癌細胞株(os-rc-2、ACHN、769-P、Kert-3、786-O、a498)中HOTAIR表達情況及其增殖和遷移運動能力，篩選出低表達低遷移能力的細胞株769-P和高表達高遷移能力的細胞株786-O作為研究對象，運用慢病毒(pLenti GFPPuro-HOTAIR)轉(zhuǎn)染腎癌細胞系769-p后，構(gòu)建穩(wěn)定高表達HOTAIR的細胞株769-p-HOTAIR，再運用shRNA干擾786-O

8、中的HOTAIR，構(gòu)建穩(wěn)定沉默HOTAIR的細胞株786-O-siRNA，選擇在不影響增殖、凋亡情況下，分別考察它們體外運動遷移能力。
　　3.選擇769-P、769-P-NC、769-P-HOTAIR和786-O、786-O-NC、786-O-siRNA進行瘤鼠模型的建立，考察他們在體內(nèi)增殖力和轉(zhuǎn)移能力。以及體外、內(nèi)實驗考察姜黃素對細胞株的遷移運動能力和各組瘤鼠的抑制影響情況。
　　結(jié)果：
　　1.各樣本組HOTAI

9、R mRNA均有表達，轉(zhuǎn)移灶HOTAIR的表達顯著高于腎癌原發(fā)灶(P=0.0086)和癌旁正常腎組織(P=0.0060);腎癌原發(fā)灶與癌旁正常腎組織中HOTAIRmRNA的表達組間無顯著差異性(p=0.281)。
　　2.正常腎細胞HK-2 HOTAR的表達水平明顯低于三種腎癌細胞株os-rc-2(P=0.0173)、kert-3(P=0.0011)和786-O(P=0.0003)，高轉(zhuǎn)移性腎癌細胞系(os-rc-2，786-O)

10、中HOTAIR的水平明顯高于低轉(zhuǎn)移性腎癌細胞株(achn，769-p)。os-rc-2與achin、769-p比較，P值分別為:0.0186和0.0146;786-O與achin、769-p比較，P值分別為:0.004和0.0007。
　　3.Transwell小室試驗檢測五種腎癌細胞系遷移運動能力，786-O、kert-3細胞遷移運動能力均較強，與769-p細胞比較，均具有顯著差異，P值分別為0.0002，0.0006;與ach

11、n細胞比較，均具有顯著差異，P值分別為0.0035，0.004;與os-rc-2細胞比較，均具有顯著差異，P值分別為0.0042，0.0022;
　　4.攜帶HOTAIR的慢病毒載體感染的769-p細胞的HOTAIR明顯高表達(P=0.0005)，而攜帶vector的慢病毒載體感染的769-p細胞的HOTAIR水平無明顯變化(P=0.4810)。兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的786-O-siRNA細胞株HOTAIR mRNA表達水平顯著低于對照組

12、786-O細胞的HOTAIR mRNA表達水平，(P=0.0003，P=0.00037，)，而陰性對照NC(siGFP)的786-NC細胞，HOTAIR水平變化不明顯(P=0.1904)。
　　5.在24h和48h769-p-HOTAIR、769-p-NC、769-p細胞增殖情況組間比較無顯著差異，在72h769-p-HOTAIR組相比769-p、769-p-NC組，細胞增殖的差異有統(tǒng)計學意義(p=0.00536，p=0.0092

13、)，此外，769-p-NC組與769-p組也有顯著性差異(p=0.0078)。在24h，786-O-shHOTAIR、786-O-NC、786-O細胞增殖情況組間比較無顯著差異，在48h和72h，786-O-shHOTAIR組相比786-O-NC、786-O組，細胞增殖的差異有統(tǒng)計學意義。786-O-shHOTAIR在48h相比786-O組，細胞增殖減少(p=0.0084)，在72h相比786-O組，細胞增殖減少(p=0.0002);7

14、86-O-shHOTAIR在48h相比786-O-NC組，細胞增殖顯著性減少(p=0.0042)，在72h相比786-O-NC組，細胞增殖顯著性減少(p=0.00018);此外，786-O-NC組與786-O組在48h、72h有顯著性增加(p=0.0067， p=0.0053)。
　　6.769-p-HOTAIR相比769-p-NC、769-p細胞株，遷移運動能力顯著增加，P值分別為0.0031，0.0017。769-p-NC與7

15、69-p細胞株的遷移運動能力無顯著性差異。786-O-shHOTAIR相比786-O-NC、786-O細胞株，遷移運動能力顯著降低，P值分別為0.0034，0.0021。786-O-NC與786-O細胞株的遷移運動能力無顯著性差異。
　　7.體內(nèi)實驗顯示:786-O和786-o-NC組腫瘤體積、瘤重、生長速度的增加幅度比786-o-shRNA大，差異具有統(tǒng)計學意義。769-p-HOTAIR組腫瘤體積、瘤重、生長速度增加的幅度比76

16、9-p、769-p-NC大，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　8.姜黃素對4株人腎癌細胞769-p、769-p-vector、769-p-HOTAIR和786-O的體外實驗:姜黃素對四種腎癌細胞的生長具有抑制作用，且呈時間-劑量依賴性。姜黃素終濃度＞10μM時，細胞生長抑制作用顯著，且差異有統(tǒng)計學意義(P=0001～0.0083);姜黃素終濃度≤10μM，在24 h內(nèi)對細胞的生長無明顯抑制作用。transwell小室法檢測結(jié)果顯示，姜黃素

17、對769-p-HOTAIR、786-O兩種細胞遷移運動均有抑制作用，且呈明顯的劑量依賴性。在姜黃素終濃度≥5μ M時，對細胞遷移運動的抑制作用與對照組相比差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P=0017～0.0030)。然而，同樣條件下，姜黃素(5-10μ M)對Kert細胞的遷移運動無明顯抑制作用(P=0831～0.1341)。
　　結(jié)論：
　　LncRNA-HOTAIR介導腎癌細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的過程，同時本研究還證實姜黃素可以抑