長鏈非編碼RNA在脊柱轉(zhuǎn)移瘤及肝細(xì)胞癌中的作用與臨床意義研究.pdf

1、隨著環(huán)境污染及食品安全問題日趨嚴(yán)重，吸煙、飲酒等不良生活習(xí)慣逐漸向年輕化發(fā)展，致使腫瘤發(fā)病率逐年增高。目前腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的重大疾病。我國不管發(fā)病率還是死亡率均居世界前列，給國民健康造成了極大的危害。腫瘤及其相關(guān)并發(fā)癥的研究越來越被研究者們所重視。雖然近些年在腫瘤診斷方法及治療手段上已取得長足的進(jìn)步。但對于肺癌、肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤的治療效果、預(yù)后和遠(yuǎn)期生存率仍然較差。其主要原因歸結(jié)為對腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識不夠深入。

2、　　脊柱為腫瘤骨轉(zhuǎn)移最為常見的部位，高達(dá)70％的癌癥患者會發(fā)生脊柱轉(zhuǎn)移。脊柱轉(zhuǎn)移瘤可導(dǎo)致脊髓壓迫及病理性骨折，使患者癱瘓，完全失去自理能力。嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，從而加速病情的進(jìn)展。至今國內(nèi)外學(xué)者對腫瘤脊柱轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚，致使缺乏有效的治療方法。因此脊柱轉(zhuǎn)移瘤的治療仍然是困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題。手術(shù)雖然能有效促進(jìn)恢復(fù)，但并發(fā)癥多，創(chuàng)傷較大且短時(shí)間內(nèi)容易復(fù)發(fā)，使部分患者在術(shù)后一月內(nèi)死亡。因此，探尋介導(dǎo)腫瘤脊柱轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶分子，是提高脊

3、柱轉(zhuǎn)移瘤病人臨床療效，改善患者預(yù)后及生存質(zhì)量的新方向。
　　部分腫瘤具有較強(qiáng)的嗜骨性，晚期容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，例如肝癌、肺癌、乳腺癌等。脊柱為肝癌骨轉(zhuǎn)移最為常見的部位，發(fā)生脊柱轉(zhuǎn)移患者存活率不到3%。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的90%以上。患者常常伴有肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移。HCC早期臨床癥狀及體征多不典型，很難及早發(fā)現(xiàn)。明確診斷時(shí)大多病程已進(jìn)入中、晚期，失

4、去手術(shù)機(jī)會。因其惡性程度高、早期發(fā)現(xiàn)難、進(jìn)展速度快、治療復(fù)雜、術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率較高等特點(diǎn)，使HCC患者療效不佳，預(yù)后較差。以往對HCC研究主要以microRNA及編碼蛋白的RNA為主，長鏈非編碼RNA研究相對較少。目前國內(nèi)外對HCC的分子機(jī)制研究還不夠深入，因此我們需進(jìn)一步對HCC在發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行探索。尋找可預(yù)測HCC發(fā)生的分子標(biāo)志物，為HCC診療開辟新途徑。
　　人類基因組是由龐大且復(fù)雜的核苷酸序列排

5、列而成。目前已知可編碼蛋白的基因僅占人類基因組序列的2%，其余98%不具備編碼蛋白能力的序列被認(rèn)為是基因組中無用的“噪聲”。這類從基因組轉(zhuǎn)錄而來，且不編碼蛋白的RNA分子稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。早期，研究者僅僅對編碼RNA進(jìn)行關(guān)注，但近年來人們的目光逐漸被非編碼RNA所吸引。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與人類多種疾病如阿爾茨海默癥、

6、腫瘤、亨廷頓氏病的發(fā)生、發(fā)展存在著重要的關(guān)系。
　　LncRNA轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt，且不具備蛋白編碼的能力。最新研究表明， lncRNA在生命活動過程中扮演著重要角色，可通過調(diào)控mRNA和蛋白表達(dá)水平影響生物學(xué)行為。目前越來越多的腫瘤相關(guān)lncRNA得以發(fā)現(xiàn)，其通過多種方式調(diào)控著腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵潤與凋亡，成為全新腫瘤標(biāo)志物及藥物靶標(biāo)，顯著推進(jìn)了腫瘤研究的進(jìn)展。
　　Ji等通過測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（me

7、tastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1），對225例Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者進(jìn)行篩查。發(fā)現(xiàn)70例轉(zhuǎn)移患者的樣本中MALAT1過表達(dá)，且具有病程及組織特異性。提示MALAT1可作為Ⅰ期NSCLC患者潛在標(biāo)志物。該基因在其他腫瘤中也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但在NSCLC患者中的表達(dá)最為顯著。MALAT1可通過激活

8、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，還可參與mRNA前體的可變剪切和絲氨酸/精氨酸剪接因子的磷酸化修飾，來影響基因的功能及表達(dá)。
　　隨著對腫瘤基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)不但同種腫瘤中可存在不同的lncRNA，而且同一lncRNA也可在不同腫瘤中差異表達(dá)。HULC最早發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)，可作為原發(fā)性肝癌較為敏感的分子標(biāo)志物，其在前列腺癌、胃癌中也出現(xiàn)異常表達(dá)情況。H19作為一個(gè)原癌基因，在多種消化系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)量

9、升高。
　　綜上所述，lncRNA在腫瘤學(xué)研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前，脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者多采取微創(chuàng)治療方案，脊柱后路開放式手術(shù)相對較少。因此組織樣本較為珍貴，收集相對困難，且骨組織RNA較難提取。致使國內(nèi)外對于lncRNA在脊柱轉(zhuǎn)移瘤中的研究尚處空白。LncRNA在HCC中的研究仍然較少，并且絕大多數(shù)lncRNA調(diào)控機(jī)制尚不明確。由此提示我們，是否可以通過高通量測序技術(shù)進(jìn)行篩選及驗(yàn)證，找到全新的關(guān)鍵lncRNA作為腫瘤診斷及治療

10、靶標(biāo)，為脊柱轉(zhuǎn)移瘤和HCC臨床診療提供新策略?；诖宋覀冮_展了以下三部分研究，現(xiàn)總結(jié)如下。
　　第一章：脊柱轉(zhuǎn)移瘤轉(zhuǎn)錄組lncRNA表達(dá)譜分析
　　目的：
　　建立脊柱轉(zhuǎn)移瘤差異表達(dá)lncRNA及mRNA表達(dá)譜，并對其長度及外顯子數(shù)量進(jìn)行預(yù)測。明確差異表達(dá)mRNA可富集的分子功能、生物學(xué)過程和疾病通路相關(guān)信息。
　　方法：
　　對脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者配對組織（腫瘤組織及癌旁組織）中RNA進(jìn)行提取，利用高通量測序技

11、術(shù)構(gòu)建脊柱轉(zhuǎn)移瘤中差異表達(dá)lncRNA及mRNA表達(dá)譜。隨后通過pathway分析及GO分析對差異表達(dá)mRNA的分子功能、參與生物學(xué)過程及疾病通路進(jìn)行富集。最后對差異表達(dá)lncRNA長度及外顯子數(shù)目進(jìn)行預(yù)測，并通過對比與編碼基因間位置關(guān)系，將差異表達(dá)lncRNA分類。
　　結(jié)果：
　　通過高通量測序技術(shù)，在脊柱轉(zhuǎn)移瘤組織中找到171條差異表達(dá)lncRNA和2929條差異表達(dá)mRNA，其中有66條全新未被報(bào)道的lncRNA。對

12、差異表達(dá)mRNA進(jìn)行pathway分析和GO分析。結(jié)果顯示，脊柱轉(zhuǎn)移瘤中差異表達(dá)的mRNA可富集到31種疾病，79種通路及1535種分子功能，其中包括腫瘤相關(guān)疾病及腫瘤相關(guān)通路。進(jìn)一步明確了脊柱轉(zhuǎn)移瘤中異常表達(dá)mRNA參與的分子功能、生物學(xué)過程和對疾病通路的調(diào)節(jié)。171條差異表達(dá)lncRNA中，大部分外顯子數(shù)目小于5個(gè)，長度小于10000nt，均少于mRNA。其中Antisense共有50條，已知的19條，未知的31條；Sence共有5

13、3條，已知的51條，未知的2條；Bidirectionsl共有6條，已知的4條，未知的2條；Intergenic共有40條，已知的20條，未知的20條；Intronic共有22條，已知的8條，未知的14條。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了脊柱轉(zhuǎn)移瘤lncRNA、mRNA表達(dá)譜。在171條差異表達(dá)lncRNA中發(fā)現(xiàn)66條全新未被報(bào)道的lncRNA。明確了2929條差異表達(dá)mRNA參與的分子功能、生物學(xué)過程和對疾病通路的調(diào)節(jié)。為腫瘤

14、學(xué)研究及后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源。
　　第二章：lnc000489在脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者血漿中的表達(dá)及臨床特征相關(guān)性分析
　　目的：
　　通過在血漿中驗(yàn)證，找出脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者血漿中高表達(dá)的lncRNA。
　　了解其分子功能、生物學(xué)過程和疾病通路相關(guān)信息。明確其在脊柱轉(zhuǎn)移瘤中的診斷價(jià)值。
　　方法：
　　從前期構(gòu)建的脊柱轉(zhuǎn)移瘤lncRNA表達(dá)譜中挑選20條全新的lncRNA。將脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者血漿設(shè)為實(shí)驗(yàn)組

15、，健康志愿者血漿設(shè)為對照組。通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測候選lncRNA在血漿中表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)分析后找出在脊柱轉(zhuǎn)移瘤中具有顯著差異的lncRNA。利用ROC曲線計(jì)算靈敏度和特異性。隨后對差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行共表達(dá)分析，并對共表達(dá)mRNA進(jìn)行pathway和GO分析。最后統(tǒng)計(jì)分析差異表達(dá)lncRNA與臨床特征間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者血漿中l(wèi)nc00489表達(dá)量相對于健康志愿者顯著升高（P<0.05），ROC

16、曲線分析顯示lnc00489對脊柱轉(zhuǎn)移瘤具有一定的診斷價(jià)值。與lnc00489存在共表達(dá)關(guān)系的mRNA共有51條，可富集到實(shí)體腫瘤、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌等多種腫瘤相關(guān)疾病和Wnt、Hh、Hedgehog signaling pathway、Basal cell carcinoma等腫瘤相關(guān)通路，進(jìn)一步說明了lnc00489可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。Lnc00489表達(dá)量與臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，顯示lnc00489與轉(zhuǎn)

17、移椎體個(gè)數(shù)及是否伴有內(nèi)臟轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。轉(zhuǎn)移椎體數(shù)量越多病情相對嚴(yán)重。腫瘤主要的轉(zhuǎn)移途徑為血運(yùn)轉(zhuǎn)移，內(nèi)臟及椎體血供相對豐富。綜上所述lnc00489可能在腫瘤脊柱轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用，其有望成為潛在的血漿標(biāo)志物，為脊柱轉(zhuǎn)移瘤的診斷及治療提供了新思路。
　　結(jié)論：
　　Lnc00489表達(dá)量在脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者血漿中顯著升高，對脊柱轉(zhuǎn)移瘤具有一定的診斷價(jià)值。與lnc00489共表達(dá)的mRNA可富集到多種腫瘤相關(guān)疾病和通路。血漿

18、中l(wèi)nc00489表達(dá)量與轉(zhuǎn)移椎體數(shù)量和是否伴有內(nèi)臟轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，其有望成為診斷脊柱轉(zhuǎn)移瘤全新的血漿分子標(biāo)志物。
　　第三章：lnc34822在HCC患者血漿中表達(dá)及臨床特征相關(guān)性研究
　　目的：
　　從構(gòu)建的lncRNA數(shù)據(jù)庫中找到一條在HCC中差異表達(dá)的lncRNA，明確其在HCC中的診斷價(jià)值。
　　方法：
　　利用前期建立的lncRNA數(shù)據(jù)庫，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研篩選出10條高表達(dá)lncRNA。通過在H

19、CC患者組織及血漿中驗(yàn)證，明確是否存在高表達(dá)的lncRNA。ROC曲線分析計(jì)算診斷靈敏度和特異性。利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測候選lncRNA在組織、血漿及細(xì)胞系（Hep3B、HepG-2、SMMC-7721、Huh7.5、LO2）中表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析差異表達(dá)lncRNA在血漿中的穩(wěn)定性，與外周血細(xì)胞間關(guān)系，不同細(xì)胞系中表達(dá)情況，在HCC患者術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)時(shí)表達(dá)量的變化情況和與臨床特征間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　有報(bào)道稱，同

20、種lncRNA可在不同腫瘤中進(jìn)行調(diào)控，同種腫瘤也可受到多種不同lncRNA的影響。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研從構(gòu)建的脊柱轉(zhuǎn)移瘤lncRNA表達(dá)譜中篩選出10條高表達(dá)lncRNA。經(jīng)過在HCC患者組織及血漿中驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)lnc34822在HCC中表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.01），并且可以在血漿中穩(wěn)定表達(dá)。Lnc34822在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞系，且與外周血細(xì)胞沒有相關(guān)性。ROC曲線分析顯示，lnc34822對HCC具有一定的診斷價(jià)值。Ln

21、c34822在HCC患者術(shù)后血漿中表達(dá)量明顯降低，而復(fù)發(fā)時(shí)又迅速升高，由此推斷l(xiāng)nc34822有望成為一個(gè)動態(tài)監(jiān)測HCC患者病情進(jìn)展的血漿標(biāo)志物。通過與臨床信息相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)lnc34822血漿中表達(dá)量與AFP及肝上腫瘤個(gè)數(shù)呈正相關(guān)。肝癌患者血液中AFP含量顯著升高，目前已成為臨床上廣泛應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物。肝上腫瘤數(shù)量越多病情越嚴(yán)重。進(jìn)一步說明了lnc34822有望成為HCC潛在的血漿診斷標(biāo)志物。
　　結(jié)論：
　　Lnc348