RNAi技術干擾骨肉瘤細胞Dll4表達抑制侵襲轉移和血管生成的體內外實驗研究.pdf

1、目的：探討D114在骨肉瘤組織的表達及意義；靶向沉默D114的表達對骨肉瘤侵襲轉移和血管生成的作用機制。 方法： (1)采用免疫組化的方法檢測62例骨肉瘤組織中D114蛋白的表達，結合臨床病理資料分析，研究D114的表達與臨床病理特征的關系。 (2)構建全長的逆轉錄病毒pSUPER- D114-siRNA質粒，通過鑒定后，將其穩(wěn)定轉染到PT67細胞培養(yǎng)，獲得分泌D114蛋白病毒血清，干預沉默入骨肉瘤細胞株SOSP

2、-9607E10中D114的表達；干預沉默人微血管內皮細胞系(HMEC-1)，體外采用劃痕實驗、Transwell侵襲實驗、血管成管實驗、MTT和流式細胞儀檢測等方法，研究D114調控骨肉瘤細胞分化增殖、骨肉瘤侵襲運動和骨肉瘤血管成管的分子機制驗證D114調控骨肉瘤血管成管的分子機制導致腫瘤生物學行為的改變。 結果： (1) Notcb1、D114在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達Notchl蛋白的陽性表達主要在腫瘤細胞的細胞質

3、或細胞膜，呈棕黃色，散在分布。62例骨肉瘤中有53例呈陽性表達，陽性率為85.5％(53/62)，對照組為21.2％(9/43)，兩組差異具有顯著性(P<0.05)。D114蛋白的陽性表達主要在腫瘤細胞的細胞質或細胞膜，部分表達在血管內皮細胞。62例骨肉瘤中有55例呈陽性表達，陽性率為88.7％(54/62)，對照組為23.6％(10/43)，兩者之間差別具有顯著性(P<0.05)，Notch1和D114在骨肉瘤中的表達高于在骨軟骨瘤中

4、的表達，提示Notch1和D114可能參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。 (2).Notch1、D114表達及其與骨肉瘤病理臨床指標的關系 Notchl與D114在骨肉瘤中表達存在正相關關系，相關系數(shù)rs為0.842，P-0.027。Notch1及D114蛋白表達與骨肉瘤組織分化程度、Ennecking分期和有無轉移密切相關(P<0.05)，但與腫瘤直徑、性別、年齡、ALP(堿性磷酸酶)無關(P>0.05)。 (3)骨

5、肉瘤中Notch1和D114表達與MVD表達的關系 Notch1高表達組MVD為35.2±9.3，顯著高于低表達組28.3±3.4，此外，D114高表達組MVD為36.2±7.2，顯著高于低表達組29.5±2.2，差別具有顯著性(P<0.05)。骨肉瘤中Notch1和D114表達與MVD表達的具有相關性(P<0.05)，Notchl及D114蛋白高表達可能在骨肉瘤血管生成進程中起重要作用。 (4) D114的表達與骨肉

6、瘤的侵襲轉移潛能密切相關 D114 mRNA和蛋白在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10兩株細胞中的表達。結果顯示：在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10兩個骨肉瘤細胞株細胞中，D114 mRNA和蛋白表達水平分別0.43±0.11 vs0.86±0.09、0.47±0.05vs0.82±0.08，具有顯著性差異(P<0.05)。 (5)逆轉錄病毒介導的小RNA干擾特異性沉默SOSP-9607E

7、IO癌細胞系中D114的表達 SOSP-9607E10D114RNAi+中D114的表達被明顯抑制，較對照組而言，其抑制效率超過70％(P<0.05)，而作為對照的SOSP-9607E10D114RNAi-中D114的表達較SOSP-9607E10細胞系無明顯變化。以上結果提示本研究中采用逆轉錄病毒介導的小RNA干擾能夠有效特異的沉默SOSP-9607E10骨肉瘤細胞中D114的表達。 (6)體外實驗中抑制D114的表

8、達可以抑制骨肉瘤細胞的侵襲遷移而不影響其增殖和凋亡 SOSP-9607E10D114RNAi+較SOSP-9607ElOD114RNAi-細胞遷移能力明顯下降，24小時劃痕愈合率分別為62％vs77％，差異具有顯著性意義(P<0.05)。采用Transwell侵襲小室測定法比較SOSP-9607E10D114RNAi+和SOSP-9607E10D114RNAi-的侵襲能力，結果顯示SOSP-9607E10D114RNAi+和S

9、OSP-9±607E10D114RNAi-細胞侵襲能力明顯下降，24小時培養(yǎng)后穿過Transwell的每低倍視野細胞數(shù)分別為63±11' vs129±13，差異具有顯著性意義(P<0.05)。用MTT法比較SOSP-9607E10D114RNAi+和SOSP-9607E10D114RNAi-的增殖能力，差異不具有顯著性意義(P>0.05)。檢測SOSP-9607E10D114RNAi+和SOSP-9607E10D114RNAi-的凋亡情

10、況，兩組細胞差異不具有顯著性意義(P>0.05)。 (7)體內抑制D114的表達可以抑制骨肉瘤細胞的成瘤能力 比較MiceD114RNAi+和Mice D114RNAi-兩組裸鼠模型中SOSP-9607E10原發(fā)瘤的大小，結果顯示皮下種植45天后SOSP-9607E10原發(fā)瘤的大小(cm3)分別為3.010.22和3.45±0.23，差異具有顯著性意義(P<0.05)，比較MiceD114RNAi+和MiceD114RN

11、Ai-兩組裸鼠模型SOSP-9607E10原發(fā)瘤中的MVD，結果顯示MiceD114RNAi+和Mice D114RNAi-兩組裸鼠模型SOSP-9607E10原發(fā)瘤中每高倍鏡視野平均MVD值分別為29±2和37±3，差異具有顯著性意義(P<0.05)。 (8)體外實驗中抑制D114的表達可以抑制HMEC-1人微血管內皮細胞的侵襲遷移而不影響其增殖和凋亡 實驗組HMEC-1D114RNAi+較對照組HMEC-1D114R

12、NAi-細胞遷移能力明顯下降，24小時劃痕愈合率分別為69％ vs92％，差異具有顯著性意義(P<0.05)。細胞侵襲能力也明顯下降，24小時培養(yǎng)后穿過Transwell的每低倍視野細胞數(shù)分別為49±6 vs70±3，差異具有顯著性意義(P<0.05)。MTT法比較HMEC-1D114RNAi+較對照組HMEC-1D114RNAi-的增殖能力，差異不具有顯著性意義(P>0.05)。兩組細胞的凋亡差異不具有顯著性意義(P>0.05)。

13、 (9)體外實驗中抑制D114的表達可以抑制HMEC-1人微血管內皮細胞的血管生成 HMEC-1 D114RNAi+組不能成管；對照組成管指數(shù)為2397±726，實驗組成管指數(shù)為489±215，兩組差異具有顯著性意義(P<0.05)。三維血管新生模型對照組和實驗組中每10個微載體成管數(shù)分別為45±9和9±7，差異具有顯著性意義(P<0.05)，這些結果說明體外抑制D114的表達可以抑制HMEC-1人微血管內皮細胞的血管生成

14、。 (10)體內實驗中抑制D114的表達可以抑制VEGF誘導的血管生成 實驗組Matrigel中的新生血管少于對照組，實驗組和對照組Matrigel中新生血管總長度分別為23634±6421μm和32145±4314μm，差異具有顯著性意義(P<0.05)這說明體內實驗中抑制的D114表達可以抑制VEGF誘導的新生血管生成。 結論：D114在骨肉瘤中的高表達可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，D114可能作為預測骨肉瘤不