新型釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip抗骨肉瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨肉瘤是骨原發(fā)性惡性腫瘤發(fā)病率最高的疾病，青少年好發(fā)且死亡率高。其惡性程度高、早期肺轉(zhuǎn)移和預(yù)后極差。首選治療方案為保肢手術(shù)并加以大劑量化療；而已發(fā)生轉(zhuǎn)移病人則選擇化療治療，化療起著重大作用。現(xiàn)今經(jīng)典骨肉瘤化療藥物為順鉑、甲氨蝶呤和阿霉素等。但因其肝腎毒性、骨髓毒性、耳毒性、外周神經(jīng)毒性等副作用和耐藥問題，制約了其臨床上的長期高療效使用，所以骨肉瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高居不下。因此，研發(fā)新型低副作用和高療效抗骨肉瘤藥物尤為必要。
　　研究發(fā)

2、現(xiàn)釕類配合物能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，具有抑瘤作用強(qiáng)、毒性低、易吸收、易排出且易被腫瘤組織吸收的特點(diǎn)，其中某些釕配合物已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。
　　本研究通過合成的新型釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip作用于骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和HOS，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討驗(yàn)證其抗腫瘤作用，為治療骨肉瘤提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1通過觀察體外實(shí)驗(yàn)新型釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63和HOS凋亡作用的影響，

3、探討釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip對人骨肉瘤的抗腫瘤作用和初步機(jī)制。
　　2建立骨肉瘤皮下荷瘤模型，觀察釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip對人骨肉瘤細(xì)胞HOS皮下荷瘤增殖的影響，探討釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip的體內(nèi)抗腫瘤作用，并為釕(Ⅱ)配合物的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1、體外實(shí)驗(yàn)
　　1.1 CCK8法檢測釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip對人骨肉瘤MG-63、HOS細(xì)胞株細(xì)胞活性的影響。

4、
　　1.2 Hoechst33258熒光染色觀察不同濃度釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip對骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞核的影響。
　　1.3 AO/EB熒光染色法觀察不同濃度釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip處理骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞凋亡形態(tài)變化。
　　1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip處理骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況。
　　1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip處理骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞周期變

5、化。
　　1.6 JC-1熒光探針檢測不同濃度釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip處理骨肉瘤細(xì)胞后線粒體膜電位變化。
　　1.7免疫印跡法驗(yàn)證不同濃度釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip處理骨肉瘤細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白BCL2、BAX和Caspase3表達(dá)變化。
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　2.1實(shí)驗(yàn)分組：①空白對照組：生理鹽水；②陽性對照組：順鉑組，3mg/kg；③釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip組：a.低濃度組，1/20 LD

6、50濃度，即1.34mg/kg；b.中濃度組：1/10 LD50濃度，即2.67mg/kg；c.高濃度組：1/5 LD50濃度，即5.35mg/kg。
　　2.2模型建立及給藥方案：裸鼠右腋下消毒后注射5×107個(gè)細(xì)胞懸液，24h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組腹腔注射給藥，連續(xù)7天。
　　2.3結(jié)果監(jiān)測：瘤塊每隔2天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，根據(jù)體積=長×寬2/2計(jì)算體積，測量體重變化。給藥18天后，處死裸鼠測量腫瘤重量和肝肺重量，計(jì)

7、算臟器系數(shù)評價(jià)藥物對臟器損害，計(jì)算藥物抑瘤率：（陰性對照組瘤重量-實(shí)驗(yàn)組瘤重量）/陰性對照組瘤重量×100％。
　　結(jié)果:
　　1、釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip抗骨肉瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　1.1體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip能顯著的抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63和HOS的細(xì)胞活性，呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)；對MG-63細(xì)胞的24h、48h和72h的 IC50分別為；>500μM、247.98±34

8、.19μM和7.54±0.41μM；釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip對HOS細(xì)胞的24h、48h和72h的IC50分別為：196.5±21.8μM、35.6±2.6μM和22.75±0.44μM。
　　1.2 Hoechst-33258染色觀察顯示：與實(shí)驗(yàn)組對比，對照組人骨肉瘤MG-63和HOS細(xì)胞胞核完整，著色均勻，熒光彌散；不同濃度釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip處理細(xì)胞，染色質(zhì)凝聚皺縮，著色不規(guī)則，細(xì)胞核會呈致密濃染，或呈碎

9、塊狀，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡皺縮核碎裂等典型變化，而且與釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip濃度相關(guān)。
　　1.3 AO/EB熒光染色法觀察顯示：對照組MG-63細(xì)胞和HOS細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)未改變，呈均勻黃綠色熒光；低濃度釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip處理后細(xì)胞形態(tài)改變，核質(zhì)體呈綠色或橙色，染色質(zhì)濃縮或碎裂呈點(diǎn)狀?？梢妷乃兰?xì)胞呈橙黃色或紅色。
　　1.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡顯示：釕（Ⅱ）配合物dmpNAdp

10、ip能夠誘導(dǎo)MG-63和HOS細(xì)胞凋亡壞死，并呈劑量相關(guān)性。MG-63細(xì)胞藥物處理后（0、25μM、50μM、100μM）的各組凋亡率分別是5.4±0.38%、9.06±1.88%、11.82±2.74%和17.84±0.48%；HOS細(xì)胞藥物處理后（0、25μM、50μM、100μM）的各組凋亡率分別是5.35±0.32%、7.18±0.62%、14.04±1.96%和25.93±4.03%。
　　1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變

11、化顯示：釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0、25μM、50μM、100μM）作用于骨肉瘤細(xì)胞MG-63和HOS細(xì)胞24h后流式細(xì)胞儀檢測周期變化，釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能起S期阻滯，隨劑量增加而S期阻滯效應(yīng)相應(yīng)升高（MG-63：0、25μM、50μM、100μM分別為23.16±2.18%、29.36±1.93%、36.45±2.93%和39.62±2.35%；HOS：0、25μM、50μM、100μM分別為31.94±3.

12、83%、38.16±5.32%、41.75±4.4%和41.92±2.6%）；而G0/G1期細(xì)胞比例則隨濃度增高而逐漸減少（MG-63：0、25μM、50μM、100μM分別為62.79±6.04%、50.59±3.3%、39.93±0.69%和38.4±2.95%；HOS：0、25μM、50μM、100μM分別為53.45±0.87%、48.45±6.45%、40.88±4.95%和37.83±1.83%）；G2/M期變化不明顯。

13、r>　　1.6線粒體膜電位JC1探針法檢測結(jié)果顯示：釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能明顯降低骨肉瘤細(xì)胞線粒體膜電位。對MG-63細(xì)胞，釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0、25μM、50μM、100μM）作用24h，流式細(xì)胞儀檢測相應(yīng)藥物濃度對應(yīng)線粒體膜電位降低細(xì)胞比例為：8±4.5%、28.9±4.16%、33.46±6.1%和42.83±3.33%，；對HOS細(xì)胞，釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0和6.25μM）作用24h，原

14、位裝載JC-1探針后熒光顯微鏡觀察，探針熒光從紅色向綠色轉(zhuǎn)變明顯；釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM和200μM）作用24h，全波長多功能酶標(biāo)儀檢測Green/Red熒光，結(jié)果顯示與陰性對照相比， Green/Red比值隨藥物濃度增加而升高：1.03±0.19、1.19±0.2、1.27±0.18、1.33±0.19、1.39±0.21和1.42±0.21。
　　1.7

15、免疫印跡法驗(yàn)證不同濃度釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip處理骨肉瘤細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白BCL2、BAX和Caspase3表達(dá)變化，結(jié)果顯示：釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0、25μM、50μM、100μM）作用于骨肉瘤細(xì)胞MG-63和HOS細(xì)胞24h，與陰性對照相比，骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)水平下降，而促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達(dá)升高。
　　2、釕(Ⅱ)配合物dmpNAdpip抗骨肉瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　

16、實(shí)驗(yàn)設(shè)定空白對照組，低、中、高三個(gè)藥物濃度組，順鉑為陽性對照組。結(jié)果表明:(1)與陰性對照組相比，釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能有效抑制腫瘤體積增大，隨濃度增高效果越明顯，陽性對照組順鉑效果最強(qiáng)；(2)瘤體稱重后結(jié)果表明：與陰性對照組相比，釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip組瘤體重量較輕，且隨藥物濃度增加而降低越明顯，陽性對照順鉑組瘤體重量降低最明顯，結(jié)果與時(shí)間-瘤體體積結(jié)果一致。瘤體抑制率：低濃度組為10.06%、中濃度組為12.7

17、%、高濃度組為25.26%，順鉑組為29.2%；（3）裸鼠肝臟和肺部稱重計(jì)算臟器系數(shù)表明：與陰性對照組相比，釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip組和陽性對照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明釕配合物無肝肺損害或者損害不明顯；（4）裸鼠體重實(shí)時(shí)監(jiān)測結(jié)果表明，開始給藥后，陽性對照順鉑組對裸鼠體重影響較大，有明顯的降低體重副作用，而釕（Ⅱ）配合物dmpNAdpip組與陰性對照組體重變化無明顯差異，副作用較低。
　　結(jié)論:
　　1釕（Ⅱ）配合物dm