HIV-AIDS患者外周血B細(xì)胞數(shù)量及TLR7與TLR9 mRNA表達(dá)水平的研究.pdf

1、目的： B細(xì)胞是介導(dǎo)抗病毒體液免疫最重要的細(xì)胞，在機體的免疫系統(tǒng)中扮演重要角色，B細(xì)胞數(shù)量與功能紊亂，直接影響有效的抗病毒免疫應(yīng)答。新近研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞，卻表達(dá)重要的“天然”模式識別受體—-Toll樣受體(Toll—like receptor，TLR)7與9。TLR7主要識別病毒單鏈RNA(ssRNA)；TLR9明確識別的天然配體是CpG—DNA，廣泛存在于細(xì)菌和病毒基因組中。TLR7與TLR9信號通路活

2、化決定和影響B(tài)細(xì)胞的免疫功能。 目前，對HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞數(shù)量變化的研究結(jié)論不甚明確。中國HIV/AIDS患者B細(xì)胞數(shù)量變化的研究尚未見報道。HIV/AIDS患者B細(xì)胞TLR7與TLR9mRNA表達(dá)水平如何，是否在HIV感染進程中發(fā)揮重要作用尚不明確。本文以中國遼寧未經(jīng)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV/AIDS患者為研究對象，研究HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞數(shù)量及B細(xì)胞TLR7與TLR9mRNA的表達(dá)水平，探討B(tài)細(xì)

3、胞數(shù)量及TLR7與TLR9mRNA的表達(dá)水平與HIV感染疾病進程的關(guān)系，有助于我們深入了解HIV感染中與B細(xì)胞相關(guān)的致病機制，從而為艾滋病疫苗及其佐劑的研發(fā)開辟新徑。 方法： 1、研究對象 1)由中國醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所確認(rèn)實驗室經(jīng)Western blot試驗確認(rèn)為HIV陽性的HIV/AIDS患者27例，年齡分布為20～72歲(41.9±13.1歲)，未接受抗病毒治療。根據(jù)HIV/AIDS患者感染時間和CD4+T

4、細(xì)胞數(shù)量分為典型進展HIV組(HIV組)：感染時間>5年，CD4+T細(xì)胞數(shù)量≥200個/μl，無艾滋病指征性疾??；典型進展AIDS組(AIDS組)：感染時間>5年，CD4+T細(xì)胞數(shù)<200個/μl，和/或合并艾滋病指征性疾病。 2)16例HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康者為陰性健康對照，性別、年齡與研究對象匹配，年齡分布為25～47歲(35.1±9.3歲)。 3)采集研究對象外周靜脈血10ml。調(diào)查及采血前均征得研究

5、對象同意，并簽署知情同意書。 2、T細(xì)胞與B細(xì)胞絕對值和比值測定 將20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑或20μl CD3/CD16+56/CD45/CD19TriTEST分別加入絕對計數(shù)管中，應(yīng)用逆向加樣法各加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACS MULTISET軟件檢測并進行自動分析，計算CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD19+B細(xì)胞絕對值與比

6、值。 3、密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC) 將PBS稀釋后的抗凝全血30ml沿管壁緩慢加至10ml Ficoll PaqueTM Plus淋巴細(xì)胞分離液液面上，400g、30min離心。吸取PBMC層移入另一離心管中。補充PBS至45ml，洗滌細(xì)胞2次后得到PBMC。 4、CD19+B細(xì)胞分選 應(yīng)用MACS磁珠分選系統(tǒng)分選C

7、D19+B細(xì)胞，嚴(yán)格按照說明書進行操作。每107PBMC細(xì)胞加80μl緩沖液與20μlCD19免疫磁珠，4℃孵育15min，每107細(xì)胞加2ml緩沖液洗滌細(xì)胞，300g、10 min離心，500μl緩沖液重懸細(xì)胞，使用LS柱子進行陽性分選。取106細(xì)胞加入20μl CD20-PE室溫避光孵育25分鐘，洗滌后進行流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)用Cellquest軟件進行細(xì)胞純度分析。 5、提取CD19+B細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

8、采用Qiagen公司的試劑盒RNeasy mini kit提取CD19+B細(xì)胞總RNA。使用紫外分光光度儀檢測RNA濃度及純度。取20μl總RNA，加入2μl Oligo(dT)15配制成RNA/引物混合物22μl，70℃5min熱休克，立即冰上放置5min。用Promega公司的試劑盒ImProm—Ⅱ Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：ImProm—Ⅱ5×Reaction Bu

9、ffer10μl，MgCl212μl，dNTP2.5μl，Recombinant RNasin() Ribonuclease Inhibitor20U，ImProm—Ⅱ Reverse Transcriptase2.5μl。向RNA/引物混合物中加入上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系28μl(總體積50μl)。逆轉(zhuǎn)錄條件：25℃5min；42℃1h；70℃15min。所得cDNA于—20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?6、實時定量PCR 設(shè)計目的基因

10、TLR7、TLR9和內(nèi)參GAPDH特異性引物，由invitrogen公司合成。采用ABI公司的SYBR Green試劑盒，應(yīng)用ABI7500熒光定量PCR儀進行定量檢測。25μl實時PCR反應(yīng)體系：2×Power SYBR() Green PCR Master Mix12.5μl，上下游引物各1μl，cDNA模板2μl，RNase—free water8.5μl。反應(yīng)條件：95℃10min熱啟動，95℃15sec變性、60℃1min退火

11、及延伸40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進行融解曲線分析引物的特異性。用相對定量2—()()Ct法比較各組間TLR7或TLR9的mRNA相對表達(dá)差異。每一份標(biāo)本均行復(fù)管檢測，取其均值做為目的基因的表達(dá)水平。 7、統(tǒng)計學(xué)處理 所有資料采用SPSS16軟件分析。數(shù)據(jù)均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并進行均數(shù)兩兩比較，使用Pearson進行相關(guān)性分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann—Whitney U test進

12、行比較，使用Spearman rank進行相關(guān)性分析，統(tǒng)計概率采用雙側(cè)檢驗，P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、中國HIV/AIDS患者外周血T細(xì)胞與B細(xì)胞絕對計數(shù)檢測結(jié)果 HIV/AIDS患者CD4+T細(xì)胞數(shù)量為(348.2±182.3)個/μl，顯著低于健康對照組(821.7±217.8)個/μl，P=0.000；HIV組與AIDS組CD4+T細(xì)胞數(shù)量分別為(415.3±154.9)個/μl與(138

13、.6±58.1)個/μl，均顯著低于對照組，P=0.0000。HIV/AIDS患者B細(xì)胞數(shù)量為(149.5±40.1)個/μl，顯著低于健康對照組(209.1±102.6)個/μl，P<0.05；其中，HIV組與AIDS組B細(xì)胞數(shù)量分別為(152.0±42.2)個/μl與(141.3±33.6)個/μl，均顯著低于健康對照組，P<0.05。HIV組與AIDS組外周血B細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(7.1±2.7)％與(8.6±3.4)％，與健康對照

14、組(9.2±5.5)％相比無差異。 2、中國HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性 HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞數(shù)量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著正相關(guān)(r=0.534，P=0.006)；與CD8+T細(xì)胞數(shù)量不相關(guān)(r=0.301，P=0.107)。 3、CD19+B細(xì)胞分選純度 應(yīng)用MACS磁珠分選系統(tǒng)分選CD19+B細(xì)胞，分選所得細(xì)胞用流式細(xì)胞儀測定純度，CD19+B

15、細(xì)胞純度大于90％。 4、HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞TLR7與TLR9 mRNA表達(dá)與健康對照組的比較 HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞TIR9 mRNA的表達(dá)明顯低于健康對照組(P=0.023)。HIV組TLR9 mRNA的表達(dá)與健康對照組相比無顯著差異，P=0.05；AIDS組TLR9 mRNA的表達(dá)明顯低于健康對照組(P=0.042)。各組間TLR7 mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 5

16、、HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞TLR7與TLR9 mRNA表達(dá)與健康對照組CD4+T細(xì)胞的相關(guān)性 HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞TLR9 mRNA的表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)(r=0.390，P=0.040)。HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞TLR7 mRNA的表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量不相關(guān)。 結(jié)論： 1、HIV/AIDS患者外周血B細(xì)胞數(shù)量減少，而且B細(xì)胞數(shù)量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著正相關(guān)，