中國(guó)HIV-AIDS患者外周血單核細(xì)胞活化及表面TLR4表達(dá)與疾病進(jìn)展關(guān)系的研究.pdf

1、目的: 本文研究了不同疾病進(jìn)程的中國(guó)HIV/AIDS患者外周血單核細(xì)胞的表達(dá)與活化水平及其表面TLR4的表達(dá)情況，并結(jié)合血漿TNF-α濃度及HIV病毒載量進(jìn)行分析，初步探討HIV感染后外周血單核細(xì)胞的功能狀態(tài)及其表面TLR4表達(dá)對(duì)艾滋病疾病進(jìn)程的影響及可能致病機(jī)制。 方法: 1．研究對(duì)象 由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所、遼寧省疾病預(yù)防與控制中心以及吉林省疾病預(yù)防與控制中心經(jīng)艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室Western bl

2、ot試驗(yàn)確認(rèn)為HIV陽(yáng)性，根據(jù)CD4+T細(xì)胞數(shù)量和感染時(shí)間不同，HIV/AIDS患者被分成三組：典型進(jìn)展HIV感染組，CD4+T淋巴細(xì)胞≥200個(gè)/μl，無(wú)艾滋病指征性疾病，感染時(shí)間>5年；典型進(jìn)展AIDS組，CD4+T淋巴細(xì)胞<200個(gè)/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病，感染時(shí)間>5年；HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展組，CD4+T淋巴細(xì)胞≥500個(gè)/μl，感染HIV 10年以上，未經(jīng)抗病毒治療，無(wú)艾滋病指征性癥狀。 2．T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)

3、 將20μl CD4/CD8/CD3TriTEST試劑加入CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，加入50μl EDTA抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。 3．病毒載量檢測(cè) 采用RT-PCR方法，用美國(guó)Roche公司的COBAS AMPLICOR自動(dòng)載量?jī)x測(cè)定血漿病毒載量，最低檢測(cè)限為4

4、00拷貝/毫升。 4．單核細(xì)胞功能測(cè)定及表面TLR4的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)管加入10μl FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD14、10μl PerCP標(biāo)記的小鼠抗人CD69單克隆抗體和10μl PE標(biāo)記的小鼠抗人TLR4，對(duì)照管加入等體積的FITC、PerCP、PE標(biāo)記同型小鼠IgG，分別加入100μl抗凝全血，混勻，室溫避光孵育30min，加入溶血素3ml，室溫孵育8min，1200r/min離心5min，棄上清。加入2ml PBS懸浮

5、，室溫、1200r/min離心5min，洗滌兩次，加入1％多聚甲醛的PBS200μl后懸浮，24小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。 5．密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞 離心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液，沿管壁緩慢加入等量抗凝全血，離心2000rpm，20min。用毛細(xì)管吸取界面層的PBMC，移入另一試管中。加入5倍體積的PBS液，洗細(xì)胞2次。 6．制備細(xì)胞RNA 按照QIAGEN公司細(xì)胞RNA提取

6、試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，通過(guò)全自動(dòng)紫外分光光度儀檢測(cè)所得RNA的質(zhì)量和濃度。 7．引物及探針的設(shè)計(jì)和合成 采用Primer express2.0軟件設(shè)計(jì)引物及探針，TLR4上游引物為：TGGAAGTTGAACGAATGGAATGTG，下游引物為：ACCAGAACTGCTA CAACAGATACT，探針為：FAM-AGCACACTGAGGACCGACACACCAA- TAMRA。內(nèi)參GAPDH的上游引物為：GAAGGTGA

7、AGGTCGGAGTC，下游引物為：GAAGATGGTGATGGGATTTC，探針為：FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA。 8．標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RT反應(yīng)體系為總RNA 1μg，隨機(jī)引物50pmol，5×ExScript buffer 2μl，dNTP Mixture 10mM，RNase inhibitor 10U，ExScript<'TM> R

8、Tase 10U，用RNase Free dH<,2>O補(bǔ)齊10μl。反應(yīng)條件為42℃ 30 min，95℃5min，4℃終止反應(yīng)，所得cDNA-20℃凍存?zhèn)溆?。利用上述引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增TLR4和GAPDH，PCR產(chǎn)物膠回收純化后克隆到pUCmT--vector，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌中，藍(lán)白篩選后獲得陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證。 9．實(shí)時(shí)定量PCR 采用Taqman法，應(yīng)用LightCycler(Roche，M

9、annheim，Germany)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測(cè)，以GKPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量。反應(yīng)條件：反應(yīng)體系為20μl，Premix Ex Taq<'TM>(2×)10μl，上下游引物各0.2μM，探針0.4μM，cDNA 2μl。反應(yīng)條件為：95℃10s，95℃15s，62℃1min，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后電腦用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)和CT值自動(dòng)繪出TLR4和內(nèi)參GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并可根據(jù)待測(cè)樣本的CT

10、值中自動(dòng)計(jì)算出TLR4mRNA的拷貝數(shù)。 10．血漿TNF-α的檢測(cè) 采用ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)兩次檢測(cè)，結(jié)果取平均值。 11．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)組和健康對(duì)照組各指標(biāo)的比較采用t檢驗(yàn)，各指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系采用Person相關(guān)系數(shù)分析。 結(jié)果: 1．HIV/AIDS患者外周血單核/巨噬細(xì)胞的活化及吞噬功能的比較HIV/AIDS患

11、者CD14+細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比率、CD14+抗原水平與健康對(duì)照組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組分別以CD14+細(xì)胞設(shè)門(mén)，HIV/AIDS組中CD14+細(xì)胞早期活化分子CD69的表達(dá)率明顯高于健康對(duì)照組。 2．HIV/AIDS患者外周血單核/巨噬細(xì)胞的CD69表達(dá)率與疾病進(jìn)展的關(guān)系 HIV/AIDS患者外周血單核/巨噬細(xì)胞的CD69表達(dá)率隨著CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的降低而升高，經(jīng)相關(guān)分析可知單核/巨噬細(xì)胞的CD69表達(dá)率與C

12、D4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值呈明顯負(fù)相關(guān)，r=-0.872，P<0.01；檢測(cè)不同疾病進(jìn)展階段的HIV/AIDS患者，我們發(fā)現(xiàn)HIV組和AIDS組外周血單核/巨噬細(xì)胞CD69表達(dá)率顯著增加，HIV-1 RNA病毒載量水平較高。 3．PBMC中TLR4mRNA在各組HIV/AIDS患者和健康對(duì)照者中的表達(dá)各組TLR4 mRNA含量的定量檢測(cè)結(jié)果顯示，LTNP組、HIV組和AIDS組TLR4mRNA的表達(dá)量均高于健康對(duì)照組，其中AIDS組

13、TLR4 mRNA的表達(dá)高于HIV組及LTNP組，HIV組高于LTNP組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，LTNP組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 4．PBMC中TLR4mRNA的表達(dá)水平與HIV-1病毒載量的相關(guān)性檢測(cè)不同疾病進(jìn)展階段的HIV/AIDS患者，我們發(fā)現(xiàn)HIV組和AIDS組PBMC中TLR4mRNA的表達(dá)水平顯著增加，HIV-1 RNA病毒載量水平較高。 5．HIV/AIDS患者外周血單核

14、細(xì)胞上TLR4的表達(dá)及血漿中TNF-α濃度HIV/AIDS患者外周血單核細(xì)胞上TLR4表達(dá)陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度(MFI)分別為52.19±4.37％和74.25±7.06，明顯高于健康對(duì)照組，p<0.0001；HW/AIDS患者血漿中TNF-α濃度為35.79±5.08pg/ml，與健康對(duì)照組相比差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.001。 6．HIV/AIDS 患者外周血單核細(xì)胞TLR4的陽(yáng)性表達(dá)率與血漿TNF-α濃度的相關(guān)性 HIV

15、/AIDS患者血漿TNF-α濃度隨著外周血單核細(xì)胞TLR4的陽(yáng)性表達(dá)率升高而升高，經(jīng)相關(guān)分析顯示HIV/AIDS患者血漿TNF-α濃度與外周血單核細(xì)胞TLR4的陽(yáng)性表達(dá)率成正相關(guān)，r=0.645，p<0.01。 7．HIV/AIDS患者外周血單核細(xì)胞TLR4的陽(yáng)性表達(dá)率與HIV-1病毒載量的相關(guān)性隨著外周血單核細(xì)胞上TLR4的表達(dá)率的升高，血漿中HIV-1病毒載量有上升趨勢(shì)。經(jīng)相關(guān)分析結(jié)果顯示，HIV/AIDS患者HIV-1病毒

16、載量的對(duì)數(shù)值與外周血單核細(xì)胞TLR4的陽(yáng)性表達(dá)率呈顯著正相關(guān)，r=0.708，P<0.01。 結(jié)論: 1．中國(guó)HIV/AIDS患者外周血單核/巨噬細(xì)胞的活化和吞噬功能較健康對(duì)照組有顯著上升，且與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。 2．從分子水平證實(shí)了TLR4 mRNA在中國(guó)HIV/AIDS患者中的表達(dá)上調(diào)，并且TLR4 mRNA的表達(dá)量高低與艾滋病疾病進(jìn)展有明顯相關(guān)性。 3．中國(guó)HW/AIDS患者外周血單核細(xì)胞上TLR4