Golgi體在外周血單核細(xì)胞TLR4超敏中的作用及NPY抑制效應(yīng).pdf

1、目的：
　　 臨床觀察發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重創(chuàng)傷病人膿毒血癥發(fā)生率明顯增加。一些研究認(rèn)為，創(chuàng)傷后組織、細(xì)胞破碎產(chǎn)物能夠初步激活免疫系統(tǒng)，如果此時(shí)再發(fā)生病原微生物入侵，其結(jié)果是炎癥因子過度釋放，并提出TLR4超敏的概念。已有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞Golgi體內(nèi)存在大量TLR4，但其在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中有何作用，是否參與了創(chuàng)傷后膿毒癥過程中TLR4超敏反應(yīng)，目前尚不清楚；既往已有資料證實(shí)神經(jīng)肽Y可抑制炎癥反應(yīng)，它能否抑制致敏細(xì)胞過度釋放炎癥因子

2、，尚待證實(shí)。為此，本課題擬以健康正常人免疫細(xì)胞PBMC為對(duì)象，通過建立PBMC TLR4的致敏細(xì)胞模型，旨在探索Golgi體在TLR4超敏中的作用及神經(jīng)肽Y對(duì)超敏細(xì)胞釋放炎癥因子的影響，以期深入了解TLR4致敏的機(jī)制，同時(shí)為治療創(chuàng)傷后過度炎癥反應(yīng)提供新的途徑。
　　 方法：
　　 1.梯度離心法從濃縮人外周血白細(xì)胞中分離出PBMC，以1×106/ml接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白對(duì)照組、Fn組、LPS組、Fn+LP

3、S復(fù)合組，以5ug/ml Fn或(和)1ug/mlLPS刺激PBMC0.5、2、4、8、12h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)其炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-10水平；Western blot法檢測(cè)各處理組TLR4的表達(dá)量。
　　 2.PBMC分離培養(yǎng)同前，設(shè)立空白對(duì)照組、Fn組、NPY+Fn組、LPS組、NPY+LPS組、Fn+LPS組和NPY+Fn+LPS組，先以NPY5ug/ml預(yù)處理PBMC2h，再

4、加入5ug/ml Fn或(和)1ug/ml LPS繼續(xù)刺激細(xì)胞0.5、2、4、8、12h，檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6、TNF-α和IL-10水平和細(xì)胞TLR4的表達(dá)量。
　　 3.設(shè)立Fn組、BFA+Fn組、Fn+LPS組和BFA+Fn+LPS組，用布雷菲德菌素A(brefeldinA，BFA)5ug/ml預(yù)處理PBMC3h，去除含BFA的培養(yǎng)基并洗滌細(xì)胞3次，再以5ug/ml Fn或(和)1ug/ml LPS處理PBMC0.

5、5、2、4、8、12h，檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6、TNF-α和IL-10水平和細(xì)胞TLR4的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1.Fn對(duì)LPS刺激PBMC合成和釋放炎癥因子的影響
　　 (1)IL-6：空白對(duì)照組各時(shí)相點(diǎn)IL-6均處于低水平表達(dá)，不同時(shí)相點(diǎn)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；處理0.5h后，F(xiàn)n組、LPS組和Fn+LPS組IL-6釋放量未見明顯增加(p>0.05)；處理2h后，F(xiàn)n+LPS組較之Fn

6、組和LPS組，IL-6釋放水平增加明顯(p<0.05)；處理8h后，F(xiàn)n+LPS組IL-6達(dá)釋放峰值，與空白對(duì)照組、Fn組及LPS組比較，差異非常顯著(p<0.05)：
　　 (2)TNF-α：處理0.5h后，各組之間TNF-α產(chǎn)生水平未見顯著差異(p>0.05)；與空白對(duì)照組、Fn組及LPS組比較，F(xiàn)n+LPS組在處理2h、4h、8h、12h后，TNF-α均有所增加(p<0.05)。
　　 (3)IL-10：與空白對(duì)照

7、組、Fn組及LPS組比較，F(xiàn)n+LPS組在處理0.5h、2h后，IL-10釋放量均無明顯增加(p>0.05)；處理4h后，F(xiàn)n+LPS組較之Fn組和LPS組，IL-10釋放水平增加明顯(p<0.05)，其增加趨勢(shì)也出現(xiàn)在8h和12h。
　　 (4)TLR4：與LPS組比較，F(xiàn)n+LPS組在處理0.5h后，TLR4表達(dá)量無明顯增加(p>0.05)；處理2h、4h后，F(xiàn)n+LPS組TLR4表達(dá)量明顯增加，與同時(shí)相點(diǎn)其它3組比較差異顯

8、著(p<0.05)。
　　 2.NPY對(duì)Fn增敏LPS刺激PBMC釋放炎癥因子作用的影響
　　 (1)IL-6：處理0.5h后，NPY+Fn組較之Fn組IL-6釋放量無明顯減少(p>0.05)；與LPS組比較，各時(shí)相點(diǎn)NPY+LPS組IL-6釋放量無明顯減少(p>0.05)；處理2h后，NPY+Fn組和NPY+Fn+LPS組IL-6釋放量分別低于Fn組和Fn+LPS組(p<0.05)，這種抑制作用也出現(xiàn)在4h和8h。

9、r>　　 (2)TNF-α：處理PBMC2h、4h后，NPY+Fn組較之Fn組，NPY+Fn+LPS組較之Fn+LPS組，TNF-α的釋放量明顯減少(p<0.05)，但高于同時(shí)間空白對(duì)照組和Fn組；處理8h、12h后，NPY+Fn組較之Fn組，TNF-α釋放量未見顯著減少(p>0.05)。
　　 (3)IL-10：與Fn組比較，NPY+Fn組在處理0.5h、2h后，IL-10釋放量無顯著減少(p>0.05)；處理4h、8h后，

10、NPY+Fn組較之Fn組，NPY+Fn+LPS組較之Fn+LPS組，IL-10釋放量顯著減少(p<0.05)。
　　 (4)TLR4：與Fn組比較，NPY+Fn組在處理0.5h后，TLR4表達(dá)量未見明顯減少(p>0.05)；處理2h和4h后，NPY+Fn組較之Fn組，NPY+Fn+LPS組較之Fn+LPS組，TLR4表達(dá)量顯著降低(p<0.05)。
　　 3.BFA干擾Golgi體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)后對(duì)炎癥因子合成和釋放的影響

11、r>　　 (1)處理PBMC0.5h、2h、4h后，BFA+Fn組較之Fn組，BFA+Fn+LPS組較之Fn+LPS組，IL-6、TNF-α、IL-10釋放量均明顯減少(p<0.05)。
　　 (2)TLR4：與Fn組比較，BFA+Fn組在處理0.5h、2h、4h后，TLR4表達(dá)量顯著降低(p<0.05)；與Fn+LPS組比較，BFA+Fn+LPS組在處理0.5h、2h后，TRLA表達(dá)量顯著降低(p<0.05)。
　　

12、 結(jié)論：
　　 1.Fn單獨(dú)處理PBMC可以導(dǎo)致炎癥因子釋放增加，F(xiàn)n復(fù)合LPS刺激，炎癥因子進(jìn)一步釋放，且TLR4也呈現(xiàn)相應(yīng)的表達(dá)趨勢(shì)，提示Fn能夠增加PBMC TLR4對(duì)LPS的敏感性。
　　 2.NPY能夠抑制Fn對(duì)PBMC的致敏作用，從而減少炎癥因子的釋放，可能的抑制機(jī)制是通過減少TLR4的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
　　 3.BFA抑制PBMC Golgi體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使Fn處理后TLR4表達(dá)和炎癥因子釋放均減少，G