下調(diào)TLR4預防再狹窄的作用及其與吡格列酮抑制效應的比較.pdf

1、目的：
　　近些年來，經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動脈成形術（percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA）和經(jīng)皮冠狀動脈介入術（percutaneous coronary intervention,PCI）已逐漸成為冠心病及急性冠脈綜合征血運重建的重要治療手段。然而，術后再狹窄（restenosis，RS）卻制約著這項技術的應用與發(fā)展。盡管藥物洗脫支架的問世在一定程度上降低了再狹窄的

2、發(fā)生率，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藥物洗脫支架也并非十全十美，仍面臨如遠期炎癥狀態(tài)、支架內(nèi)血栓形成以及RS等等問題?；诖?，我們擬探究是否存在更好的再狹窄預防手段，以期與現(xiàn)有的保護措施結合起來，進一步降低這種并發(fā)癥的發(fā)生率。
　　Toll樣受體4（toll like receptor4，TLR4）是哺乳動物TLR家族里第一個被發(fā)現(xiàn)的膜受體，其活化后可以激活核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB），繼而誘發(fā)一系列的局

3、部炎癥反應，最終表現(xiàn)為損傷部位內(nèi)膜增生，因此推測其在血管損傷后再狹窄過程中可能發(fā)揮重要作用。但是抑制TLR4表達后是否會減少再狹窄的發(fā)生尚不明確。
　　本研究通過RNA干擾技術下調(diào)TLR4基因，以病毒顆粒包裝將質(zhì)粒載入動物RS模型以及被脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激增殖下的人主動脈血管平滑肌細胞（Human aortic vascular smooth musclecells,HaVSMC）中，測定TL

4、R4相關的炎癥、增殖分子，觀察下調(diào)TLR4對內(nèi)膜新生的抑制程度，以及離體水平細胞增殖、遷移能力產(chǎn)生的影響，探討抑制TLR4基因表達在預防RS中的作用機制。此外，我們比較了RNA干擾與不同濃度吡格列酮對細胞增殖遷移能力的抑制效力。
　　方法：
　　1.在體實驗：根據(jù)本實驗室前期工作基礎，建立兔頸總動脈球囊損傷后再狹窄模型：選取健康新西蘭大白兔50只，隨機分成五組，即正常組(normal control,NC)，假手術組(sha

5、me,S)，模型組(model,M)，陰性質(zhì)粒轉染組(negative,N)，以及陽性質(zhì)粒轉染組(positive,P)，每組10只。NC組不予任何干預；S組行頸總動脈分離后動脈夾夾閉右側頸總動脈30分鐘；M組行右頸總動脈球囊拉傷術；N組在進行右側頸動脈球囊拉傷后隨即封閉拉傷段血管，排空積血，管腔內(nèi)注射空載的腺病毒顆粒（滴度1*109plaque forming unit,pfu）30ul，溫暖潮濕環(huán)境孵育30min；P組在進行右側頸動

6、脈球囊拉傷后管腔內(nèi)注射載有shRNA-TLR4質(zhì)粒的腺病毒顆粒（滴度1*109 pfu）30ul，余操作同N組。術后正常兔料喂養(yǎng)14天后處死，進行以下步驟：
　?。?）處死前取血，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血漿中TNF-α、IL-6水平；
　?。?）留取右頸動脈標本，進行HE染色，測量內(nèi)膜和中膜厚度并計算內(nèi)膜和中膜面積；應用免疫組化法觀察組織TLR4表達。
　?。?）留取右頸動脈標本，采用Real-Time

7、PCR測定TLR4、TNF-α、IL-6和VCAM-1 mRNA表達；
　?。?）Western blotting檢測TLR4，炎癥因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1以及增殖因子t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR蛋白的表達。
　　2.離體實驗：選取HaVSMC細胞系，分別予1μg/ml LPS刺激0h、6h、12h、24h以及48h，確定TLR4表達的峰值時間點。設計、構建2對針對TLR4特異性的shR

8、NA表達質(zhì)粒，進行慢病毒包裝，使用帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體介導的shRNA-TLR4-1，shRNA-TLR4-2和陰性對照質(zhì)粒轉染人血管平滑肌細胞系，在熒光倒置顯微鏡下檢測以確認轉染效果，并選擇TLR4抑制效率更高的一組作為shRNA陽性轉染組（positive,P），另外保留陰性轉染組（negtive,N），不加LPS刺激組（NL）以及單加LPS刺激組（L），再設三組分別給予10μmol/L（Pio10），50μmol/L（Pi

9、o50），以及100μmol/L（Pio100）吡格列酮進行預處理，除NL外各組分別予1μg/ml LPS刺激使TLR4表達達到峰值，收細胞，RT-PCR測定TLR4 mRNA表達；Western blotting檢測TLR4、NF-κB、VCAM-1、MCP-1，再測接受LPS刺激1h后上述各組t-AKT、p-AKT的蛋白表達；MTT比色法分別測定細胞增殖生長狀況；劃痕實驗測定細胞24h及48h劃痕修復率；流式細胞術檢測細胞周期分布情

10、況。
　　結果：
　　1.在體部分實驗結果：
　?。?）有創(chuàng)操作成功且存活占83.3％（40/48）；
　　（2）ELISA結果顯示：與NC組相比，S、M、N和P組血漿IL-6、TNF-α表達水平顯著升高（p<0.05）；與M及N組比較，P組血漿IL-6、TNF-α表達無統(tǒng)計學差異（p>0.05）；
　　（3）HE染色結果顯示，與NC組和S組相比，M、N和P組內(nèi)膜和中膜均增厚，內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明

11、顯增大（p<0.05）；與M和N組相比，P組內(nèi)中膜厚度、內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明顯減少（p<0.05）。免疫組化結果表明：NC組及S組血管三層結構中均未見到TLR4陽性表達細胞；M、N及P組均有TLR4陽性表達細胞，主要分布在新生內(nèi)膜層；
　　（4）qRTPCR結果顯示：與NC組和S組相比，M、N和P組TLR4、IL-6、TNF-α和VCAM-1 mRNA表達量升高（P＜0.05），與M組及N組相比，P組上述因子表達量降低（

12、P＜0.05）；
　　(5)Western-blot結果顯示：與NC組和S組相比，M、N和P組TLR4、NF-κB、MCP-1、VCAM-1、p-AKT和p-mTOR蛋白表達量升高（P＜0.05）；與M和N組相比，P組TLR4、NF-κB、MCP-1和VCAM-1蛋白表達量下降（P＜0.05），p-AKT和p-mTOR蛋白表達量無明顯變化（p>0.05）。
　　2.離體部分實驗結果：
　?。?）1μg/mL LPS刺激

13、HaVSMC可激活TLR4，并呈現(xiàn)時間依賴性，24h達到其表達峰值；
　?。?）兩條shRNA-TLR4質(zhì)粒轉染進入細胞對TLR4抑制效率可達61%及55%；
　　（3）qRT-PCR示P組及吡格列酮預處理各組均可下調(diào)TLR4 mRNA表達量；
　?。?）WB示各組TLR4、NF-κB、MCP-1及VCAM-1表達及關系與qRT-PCR結果類似，LPS刺激后1h即可上調(diào)p-AKT表達量，而shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格

14、列酮均可明顯抑制其表達；
　?。?）LPS可以提高細胞增殖能力，shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮能夠抑制增殖；
　?。?）流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，LPS可以提高細胞在G2及S期的分布，shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮可減弱此效應；
　?。?）LPS促進細胞遷移，shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮可抑制遷移；
　?。?）以上吡格列酮對于細胞增殖、遷移能力的抑制以及對細胞周期分布的影響呈濃度依賴性，對上述各炎癥因子表

15、達的下調(diào)作用也存在濃度依賴性。
　?。?）shRNA-TLR4穩(wěn)轉HaVSMC細胞系對細胞增殖及遷移能力的抑制程度介于50μM-100μM吡格列酮之間。
　　結論：
　　下調(diào)TLR4可以抑制家兔頸動脈球囊損傷后再狹窄的發(fā)生，可能與其抑制局部組織TLR4及其介導的NF-κB、TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1等炎癥因子的表達有關。下調(diào)TLR4可以抑制由LPS激活的HaVSMC增殖遷移，其作用類同于50μM-1