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文檔簡介
1、目的:
近些年來,經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動脈成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)和經(jīng)皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention,PCI)已逐漸成為冠心病及急性冠脈綜合征血運重建的重要治療手段。然而,術后再狹窄(restenosis,RS)卻制約著這項技術的應用與發(fā)展。盡管藥物洗脫支架的問世在一定程度上降低了再狹窄的
2、發(fā)生率,但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藥物洗脫支架也并非十全十美,仍面臨如遠期炎癥狀態(tài)、支架內(nèi)血栓形成以及RS等等問題?;诖?,我們擬探究是否存在更好的再狹窄預防手段,以期與現(xiàn)有的保護措施結合起來,進一步降低這種并發(fā)癥的發(fā)生率。
Toll樣受體4(toll like receptor4,TLR4)是哺乳動物TLR家族里第一個被發(fā)現(xiàn)的膜受體,其活化后可以激活核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB),繼而誘發(fā)一系列的局
3、部炎癥反應,最終表現(xiàn)為損傷部位內(nèi)膜增生,因此推測其在血管損傷后再狹窄過程中可能發(fā)揮重要作用。但是抑制TLR4表達后是否會減少再狹窄的發(fā)生尚不明確。
本研究通過RNA干擾技術下調(diào)TLR4基因,以病毒顆粒包裝將質(zhì)粒載入動物RS模型以及被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激增殖下的人主動脈血管平滑肌細胞(Human aortic vascular smooth musclecells,HaVSMC)中,測定TL
4、R4相關的炎癥、增殖分子,觀察下調(diào)TLR4對內(nèi)膜新生的抑制程度,以及離體水平細胞增殖、遷移能力產(chǎn)生的影響,探討抑制TLR4基因表達在預防RS中的作用機制。此外,我們比較了RNA干擾與不同濃度吡格列酮對細胞增殖遷移能力的抑制效力。
方法:
1.在體實驗:根據(jù)本實驗室前期工作基礎,建立兔頸總動脈球囊損傷后再狹窄模型:選取健康新西蘭大白兔50只,隨機分成五組,即正常組(normal control,NC),假手術組(sha
5、me,S),模型組(model,M),陰性質(zhì)粒轉染組(negative,N),以及陽性質(zhì)粒轉染組(positive,P),每組10只。NC組不予任何干預;S組行頸總動脈分離后動脈夾夾閉右側頸總動脈30分鐘;M組行右頸總動脈球囊拉傷術;N組在進行右側頸動脈球囊拉傷后隨即封閉拉傷段血管,排空積血,管腔內(nèi)注射空載的腺病毒顆粒(滴度1*109plaque forming unit,pfu)30ul,溫暖潮濕環(huán)境孵育30min;P組在進行右側頸動
6、脈球囊拉傷后管腔內(nèi)注射載有shRNA-TLR4質(zhì)粒的腺病毒顆粒(滴度1*109 pfu)30ul,余操作同N組。術后正常兔料喂養(yǎng)14天后處死,進行以下步驟:
?。?)處死前取血,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中TNF-α、IL-6水平;
?。?)留取右頸動脈標本,進行HE染色,測量內(nèi)膜和中膜厚度并計算內(nèi)膜和中膜面積;應用免疫組化法觀察組織TLR4表達。
?。?)留取右頸動脈標本,采用Real-Time
7、PCR測定TLR4、TNF-α、IL-6和VCAM-1 mRNA表達;
?。?)Western blotting檢測TLR4,炎癥因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1以及增殖因子t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR蛋白的表達。
2.離體實驗:選取HaVSMC細胞系,分別予1μg/ml LPS刺激0h、6h、12h、24h以及48h,確定TLR4表達的峰值時間點。設計、構建2對針對TLR4特異性的shR
8、NA表達質(zhì)粒,進行慢病毒包裝,使用帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體介導的shRNA-TLR4-1,shRNA-TLR4-2和陰性對照質(zhì)粒轉染人血管平滑肌細胞系,在熒光倒置顯微鏡下檢測以確認轉染效果,并選擇TLR4抑制效率更高的一組作為shRNA陽性轉染組(positive,P),另外保留陰性轉染組(negtive,N),不加LPS刺激組(NL)以及單加LPS刺激組(L),再設三組分別給予10μmol/L(Pio10),50μmol/L(Pi
9、o50),以及100μmol/L(Pio100)吡格列酮進行預處理,除NL外各組分別予1μg/ml LPS刺激使TLR4表達達到峰值,收細胞,RT-PCR測定TLR4 mRNA表達;Western blotting檢測TLR4、NF-κB、VCAM-1、MCP-1,再測接受LPS刺激1h后上述各組t-AKT、p-AKT的蛋白表達;MTT比色法分別測定細胞增殖生長狀況;劃痕實驗測定細胞24h及48h劃痕修復率;流式細胞術檢測細胞周期分布情
10、況。
結果:
1.在體部分實驗結果:
?。?)有創(chuàng)操作成功且存活占83.3%(40/48);
(2)ELISA結果顯示:與NC組相比,S、M、N和P組血漿IL-6、TNF-α表達水平顯著升高(p<0.05);與M及N組比較,P組血漿IL-6、TNF-α表達無統(tǒng)計學差異(p>0.05);
(3)HE染色結果顯示,與NC組和S組相比,M、N和P組內(nèi)膜和中膜均增厚,內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明
11、顯增大(p<0.05);與M和N組相比,P組內(nèi)中膜厚度、內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明顯減少(p<0.05)。免疫組化結果表明:NC組及S組血管三層結構中均未見到TLR4陽性表達細胞;M、N及P組均有TLR4陽性表達細胞,主要分布在新生內(nèi)膜層;
(4)qRTPCR結果顯示:與NC組和S組相比,M、N和P組TLR4、IL-6、TNF-α和VCAM-1 mRNA表達量升高(P<0.05),與M組及N組相比,P組上述因子表達量降低(
12、P<0.05);
(5)Western-blot結果顯示:與NC組和S組相比,M、N和P組TLR4、NF-κB、MCP-1、VCAM-1、p-AKT和p-mTOR蛋白表達量升高(P<0.05);與M和N組相比,P組TLR4、NF-κB、MCP-1和VCAM-1蛋白表達量下降(P<0.05),p-AKT和p-mTOR蛋白表達量無明顯變化(p>0.05)。
2.離體部分實驗結果:
?。?)1μg/mL LPS刺激
13、HaVSMC可激活TLR4,并呈現(xiàn)時間依賴性,24h達到其表達峰值;
?。?)兩條shRNA-TLR4質(zhì)粒轉染進入細胞對TLR4抑制效率可達61%及55%;
(3)qRT-PCR示P組及吡格列酮預處理各組均可下調(diào)TLR4 mRNA表達量;
?。?)WB示各組TLR4、NF-κB、MCP-1及VCAM-1表達及關系與qRT-PCR結果類似,LPS刺激后1h即可上調(diào)p-AKT表達量,而shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格
14、列酮均可明顯抑制其表達;
?。?)LPS可以提高細胞增殖能力,shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮能夠抑制增殖;
?。?)流式細胞術分析發(fā)現(xiàn),LPS可以提高細胞在G2及S期的分布,shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮可減弱此效應;
?。?)LPS促進細胞遷移,shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮可抑制遷移;
?。?)以上吡格列酮對于細胞增殖、遷移能力的抑制以及對細胞周期分布的影響呈濃度依賴性,對上述各炎癥因子表
15、達的下調(diào)作用也存在濃度依賴性。
?。?)shRNA-TLR4穩(wěn)轉HaVSMC細胞系對細胞增殖及遷移能力的抑制程度介于50μM-100μM吡格列酮之間。
結論:
下調(diào)TLR4可以抑制家兔頸動脈球囊損傷后再狹窄的發(fā)生,可能與其抑制局部組織TLR4及其介導的NF-κB、TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1等炎癥因子的表達有關。下調(diào)TLR4可以抑制由LPS激活的HaVSMC增殖遷移,其作用類同于50μM-1
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